Сопоставление пренатальных функциональных маркеров задержки роста и развития плода с экспрессией сосудистых факторов роста в плаценте

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Задержка роста плода — актуальная проблема современного акушерства. В России встречаемость этого осложнения беременности констатируется у 3–24% доношенных и 18–40% недоношенных новорождённых [1]. Задержка роста сочетается с задержкой созревания функциональных систем плода и прежде всего — его центральной нервной системы (ЦНС), которая формируется, как правило, в условиях перинатальной гипоксии. При этом у новорождённых может наблюдаться равномерная или диссоциированная задержка становления тонических и рефлекторных реакций, а в дальнейшем около трети таких детей страдают неврологическими расстройствами: от минимальной мозговой дисфункции до тяжёлых заболеваний [2]. Дети с тяжёлой формой задержки роста и развития в школьном возрасте имеют проблемы с обучением и порой не могут даже завершить полный курс обучения в общеобразовательной школе [3].

В настоящее время основными методами пренатальной диагностики задержки роста и развития плода остаются ультразвуковая фетометрия и допплерометрия кровотока в сосудах функциональной системы мать–плацента–плод [2]. Международный консенсус, отраженный в Delphi протоколе (2016), уточнил, что при отсутствии нарушений плацентарного кровотока в каждый срок беременности задержку роста плода устанавливают, только если его предполагаемая масса ниже 3-го перцентиля, характерного для данного срока беременности. В тех же случаях, когда имеются расстройства плацентарной гемодинамики, диагноз правомочен уже при предполагаемой массе плода ниже 10-го перцентиля [2, 4]. Однако наше предыдущее исследование показало, что у 7% новорождённых, имеющих пренатальные фетометрические показатели между 5-м и 10-м перцентилем, всё же формируется задержка роста и развития даже при отсутствии нарушений плацентарного кровообращения в магистральных артериях системы мать–плацента–плод. Об этом мы судили по циклической организации функциональных состояний, характеризующих зрелость координационной и интеграционной функции ЦНС плода [2].

Известно, что развитие нормотрофного плода наблюдается при адекватных процессах васкуло- и ангиогенеза в плаценте. Последние находятся под контролем сосудистых факторов роста, таких как эндотелиальный (VEGF) и плацентарный (PlGF) факторы роста, изучению которых в последние годы придается большое значение [5–8]. Анализ экспрессии в плаценте этих факторов, её сопоставление с допплерометрическими параметрами плацентарного кровообращения и функциональными маркерами созревания ЦНС плода помогут глубже понять патогенез задержки роста и развития плода, обеспечив раннюю диагностику данного осложнения беременности, его неврологических последствий для плода и новорождённого с целью выбора адекватной тактики ведения, сроков и способа родоразрешения и постнатального неврологического сопровождения.

Цель исследования — изучить и сопоставить в III триместре беременности допплерометрические показатели в магистральных артериях функциональной системы мать–плацента–плод, а также параметры цикла активность–покой у плодов с экспрессией VEGF и PlGF в плацентах при физиологической беременности и плацентарной недостаточности с целью анализа морфофункциональных параллелей между этими показателями.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В срок физиологической зрелости цикла активность–покой у плодов (34–35 недель беременности) обследовано 29 женщин. Основную группу составили 19 пациенток. Критерии включения в основную группу: одноплодная беременность, фетометрические показатели или предполагаемая масса плода ниже 10-го перцентиля, нарушения кровотока в магистральных артериях функциональной системы мать–плацента–плод по данным допплерометрии.

Срок родоразрешения у пациенток основной группы: у 4 — 35 недель, у 3 — 36 недель, у 12 пациенток состоялись срочные роды. У всех беременных основной группы наблюдали разной степени нарушения гемодинамики в функциональной системе мать–плацента–плод [9]: I степени — у 7, II степени — у 6, III степени — у 6 пациенток. Плоды, имеющие критические нарушения в магистральных артериях плодово-плацентарной циркуляции, в нашем исследовании отсутствовали, поскольку в 34–35 недель у таких беременных уже провели родоразрешение [2]. Беременные основной группы имели экстрагенитальные заболевания: гипертоническую болезнь — 2 пациентки, вегетососудистую дистонию — 3, варикозную болезнь нижних конечностей — 3, сахарный диабет 1-го типа — 1, хронические воспалительные заболевания: пиелонефрит — 6, гастрит — 3, тонзиллит — 4. Контрольную группу составили 10 относительно здоровых женщин. Критериями включения в контрольную группу были одноплодная физиологическая беременность, фетометрические параметры выше 10-го перцентиля, отсутствие гемодинамических нарушений в функциональной системе мать–плацента–плод, срочные роды [8].

Рост плода и допплерометрические исследования плацентарного кровотока в основных артериях функциональной системы мать–плацента–плод выполняли на ультразвуковом диагностическом приборе Voluson-730 Expert (GE, США). Помимо определения стандартных индексов, характеризующих резистентность сосудов (индекс резистентности — ИР, пульсационный индекс — ПИ), проводили расчёт цереброплацентарного отношения (ЦПО).

Изучение у плодов цикла активность–покой проводили методом визуальной оценки 90-минутных кардиотокограмм, полученных на аппарате Sonicaid Team Care (Oxford, UK). Оценивали наличие цикла активность–покой, при его наличии — длительность в нём спокойного состояния в минутах. В период активного состояния плода определяли базальную частоту сердечных сокращений, амплитуды осцилляций сердечного ритма (СР) и моторно-кардиального рефлекса (МКР) [2].

У женщин основной и контрольной группы после родов проводили забор плацентарной ткани из центральной зоны плаценты для иммуногистохимического анализа экспрессии VEGF и PlGF. Для проведения иммуногистохимической реакции использовали стандартный одноэтапный протокол с демаскировкой антигена (высокотемпературной обработкой ткани) в 0,01 М цитратном буфере с рН 7,6. Для исследования использовали первичные моноклональные антитела к PlGF (1:100, Abcam, Великобритания) и первичные моноклональные антитела к VEGF (1:100, Abcam, Великобритания). Количественную оценку результатов иммуногистохимической реакции проводили на микрофотографиях, полученных с помощью системы фиксации микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Nikon Eclipse E400 (Япония), цифровой камеры Nikon DXM1200 (Япония), персонального компьютера на базе Intel Pentium 4, программного обеспечения ACT-1, версия 2.12. Дальнейшее количественное исследование проводили с помощью программы компьютерного анализа изображений Морфология 5.0 (ВидеоТесТ, Россия). Относительную площадь экспрессии VEGF и PlGF (S, %) вычисляли как отношение площади иммунопозитивных клеток к общей площади препарата в соответствии с законом Бугера–Ламберта–Бера. Использование этого показателя, являющегося базовым параметром программы ВидеоТесТ–Морфология 5.0, для анализа оптических параметров микрофотографий считали приемлемым, поскольку измерения осуществляли по аналогии со спектрофотометрическим анализом. Кроме того, определяли среднюю яркость экспрессии, отражающую интенсивность синтеза или накопления исследуемых маркеров [8].

Статистическую обработку материала проводили с помощью программных пакетов SPSS Statistics 23.0. Описание количественных данных представляли в виде медианы (Ме) и квартилей Q₁ и Q₃ в формате Ме (Q₁; Q₃). Для выявления возможной связи между показателями проводили корреляционный анализ с определением коэффициента корреляции Спирмена. Для проверки гипотезы о нормальности распределения применяли критерий Шапиро–Уилка. U-критерий Манна–Уитни применяли с целью обнаружения различий между выборками. При уровне значимости p <0,05 результаты считали статистически значимыми [2].

Проведение исследования утверждено Учёным советом Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова (протокол заседания № 1 от 26.02.2021), а также локальным этическим комитетом университета, утверждены формы информированного согласия пациента; получено информированное согласие всех пациенток на участие в исследовании и публикацию их медицинских данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Сопоставление показателей допплеровского исследования кровотока в магистральных артериях системы мать–плацента–плод у беременных основной и контрольной групп представлено в таблице 1.

 

Таблица 1. Допплерометрические параметры плацентарного кровотока у пациенток основной и контрольной группы в 34–35 недель беременности / Table 1. Doppler parameters of placental blood flow in patients of the main and the control groups at 34–35 weeks of pregnancy

Показатель	Контрольная группа (n=10)	Основная группа (n=19)	р
ИР маточных артерий	0,47 (0,44; 0,51)	0,66 (0,62; 0,69) (n=19)	0,000
ПИ маточных артерий	0,72 (0,59; 0,84)	1,43 (1,17; 1,51) (n=19)	0,000
ИР артерии пуповины	0,51 (0,49; 0,53)	0,78 (0,71; 0,81) (n=12)	0,000
ПИ артерии пуповины	0,74 (0,63; 0,79)	1,70 (1,62; 2,00) (n=12)	0,000
ИР средней мозговой артерии	0,77 (0,73; 0,81)	0,83 (0,60; 1,07) (n=12)	0,263
ПИ средней мозговой артерии	1,62 (1,44; 1,79)	1,45 (1,23; 1,67) (n=12)	0,595

Примечание. ПИ — пульсационный индекс; ИР — индекс резистентности; р дано по U-критерию Манна–Уитни (сравнение показателей основной и контрольной групп).

 

По данным таблицы 1 видно, что ИР и ПИ в маточных артериях женщин основной группы на 27 и 51% выше (соответственно), чем показатели у женщин контрольной группы. У 12 плодов женщин основной группы наблюдались нарушения плацентарной гемодинамики II и III степени. У них ИР и ПИ в артериях пуповины были на 28 и 56% соответственно выше этих показателей у плодов женщин контрольной группы. Резистентность средней мозговой артерии (СМА) у плодов женщин сопоставляемых групп не различалась.

Проведено изучение экспрессии PlGF и VEGF в центральных участках плаценты у пациенток контрольной группы и тех женщин основной группы (n=12), у которых роды произошли в срок. Данные иммуногистохимических показателей экспрессии VEGF и PLGF в плацентах этих женщин основной и контрольной группы представлены в таблице 2.

 

Таблица 2. Иммуногистохимические показатели экспрессии VEGF и PlGF в плацентах женщин основной и контрольной группы, у которых роды произошли в срок / Table 2. Immunohistochemical parameters of VEGF and PlGF expression in placentas of women of the main and control groups who delivered at term

Показатель	PLGF			VEGF
	основная группа (n=12)	контрольная группа (n=10)	p	основная группа (n=12)	контрольная группа (n=10)	p
Относительная площадь экспрессии, %	6,30 (5,25; 7,36)	11,39 (4,40; 18,39)	0,018	5,45 (3,93; 6,92)	4,07 (1,66; 6,49)	0,011
Средняя яркость экспрессии, у.е.	178,34 (173,66; 183,00)	175,18 (165,18; 185,1)	0,821	165,65 (157,96; 183,01)	175,18 (165,18; 185,18)	0,021

Примечание. PlGF — плацентарный фактор роста; VEGF — эндотелиальный фактор роста; р дано по U-критерию Манна–Уитни (сравнение показателей основной и контрольной групп).

 

По данным таблицы 2 видно, что при доношенной беременности относительная площадь экспрессии PLGF в 2 раза меньше, а относительная площадь экспрессии VEGF на 20% больше в плацентах женщин основной группы, чем в плацентах беременных контрольной группы. Кроме того, выявлено, что средняя яркость экспрессии VEGF в плацентах женщин основной группы на 7% меньше, чем в плацентах женщин контрольной группы. Средняя яркость экспрессии PLGF в сравниваемых группах достоверно не различалась.

На рисунках 1 и 2 представлены препараты плацент пациенток основной и контрольной группы. На рисунках видно, что маркер PlGF в плацентах женщин обеих групп определяется преимущественно по периферии терминальных ворсин, в отличие от экспрессии маркера VEGF, который определяется в центре ворсин.

 

Рис. 1. Сравнение площади экспрессии PlGF в терминальных ворсинах центральной части плаценты: a — пациенток основной группы; b — пациенток контрольной группы. Стрелками указана экспрессия PlGF; окраска: иммуногистохимическая реакция на PlGF. / Fig. 1. Comparison of the PlGF expression area in the terminal villi of the central part of the placenta: a — patients of the main group; b — patients of the control group. Arrows indicate PlGF expression; color: immunohistochemical reaction to PlGF.

 

Рис. 2. Сравнение площади экспрессии VEGF в ворсинах хориона центральной части плаценты: a — пациенток основной группы; b — пациенток контрольной группы. Стрелками указана экспрессия VEGF; окраска: иммуногистохимическая реакция на VEGF. / Fig. 2. Comparison of the area of VEGF expression in chorionic villi of the central part of the placenta: a — patients of the main group; b — patients of the control group. The arrows indicate VEGF expression; color: immunohistochemical reaction to VEGF.

 

Проведён корреляционный анализ между показателями экспрессии в плацентах VEGF, а также PLGF и допплерометрическими показателями кровотока в магистральных артериях функциональной системы мать–плацента–плод у пациенток основной группы. Выявлена прямая корреляционная зависимость между экспрессией VEGF в центральной зоне плаценты и ИР, ПИ в маточных артериях, а также ЦПО (r₁=0,487; p₁=0,035; r₂=0,487; p₂=0,035; r₃=0,578; p₃=0,030, соответственно). Установлена прямая корреляционная зависимость между экспрессией PLGF в центральной зоне плаценты и ИР в артерии пуповины (r=0,49; p=0,033).

Проведён также анализ зрелости координационной и интеграционной функции ЦНС у плодов женщин основной группы по данным оценки их поведения. Установлено, что у 73% плодов этих женщин в 34–35 недель цикл активность–покой отсутствовал, а поведение было представлено только активированным состоянием. У остальных 27% плодов женщин основной группы спокойное состояние в цикле активность–покой было укорочено в 2 раза по сравнению с плодами контрольной группы (р=0,000). Корреляционный анализ показал, что у плодов женщин основной группы имеется обратная зависимость между площадью экспрессии VEGF и амплитудой МКР (r=–0,866; р=0,05), а также амплитудой осцилляций сердечного ритма (r=–0,866; р=0,05).

ОБСУЖДЕНИЕ

Физиологическое развитие плаценты определяется процессами инвазии, васкуло- и ангиогенеза в трофобласте [10, 11]. Известно, что васкулогенез — это процесс образования и развития кровеносных сосудов de novo из мезодермальных клеток-предшественников. В свою очередь, ангиогенез — создание новых сосудов из уже существующих. Оба процесса имеют решающее значение в нормальном развитии плаценты, поскольку от них зависит эффективная транспортировка кислорода, питательных веществ и выведение продуктов обмена веществ [11]. Нарушения инвазии трофобласта, сопровождающиеся недоразвитием сосудистой сети плаценты, обусловливают формирование расстройств плацентарной гемодинамики и последующей задержки роста и развития плода. Основным методом пренатальной диагностики гемодинамических нарушений в функциональной системе мать–плацента–плод остаётся допплерометрическое исследование, в том числе на ранних этапах беременности. Последние имеют значение для формирования прогноза возможного развития преэклампсии и задержки роста плода [12]. Так, и в нашем исследовании у беременных основной группы, имеющих в 34–35 недель фетометрические показатели плодов ниже 10-го перцентиля, ИР и ПИ в маточных артериях были выше на 27 и 51%, а в артериях пуповины соответственно на 28 и 56% по сравнению со значениями этих параметров у пациенток контрольной группы. По данным Т.Л. Смирновой и соавт. (2009), в плацентах женщин, имеющих синдром плацентарной недостаточности (ПН), выявляется выраженный фиброз стромы стволовых, промежуточных и якорных ворсин, а также наличие многочисленных мелких ворсин, в том числе с дистрофическими и некробиотическими изменениями, слабая их васкуляризация, малая протяжённость синцитиокапиллярных мембран. В межворсинчатом пространстве и в участках повреждения эндотелия откладывается фибрин и липиды. Следствием этого становится повышение резистентности сосудов, на фоне которой снижается маточно-плацентарный и плодово-плацентарный кровоток [13].

В ряде исследований авторам удалось установить параллели между функциональными и морфологическими маркерами плацентарных нарушений. Так, А.Н. Закурина и соавт. (2010) показали, что значения допплерометрических показателей в функциональной системе мать–плацента–плод отражают морфометрию терминальных ворсин плаценты [14]. Такой подход позволяет понять патогенез нарушений созревания функциональных систем плода, которые часто предшествуют задержке его роста.

Многие из проведённых в последние годы исследований посвящены влиянию сосудистых факторов роста на морфогенез плаценты при плацентарной недостаточности и задержке роста/развития плода. Процессы васкулогенеза и ангиогенеза осуществляются под контролем сосудистых факторов роста — VEGF и PlGF. Установлено, что VEGF экспрессируют клетки трофобласта, обеспечивая дифференцировку, миграцию, пролиферацию эндотелиальных клеток и формирование сосудистой сети. Под влиянием VEGF материнские сосуды трансформируются так, чтобы обеспечить маточно-плацентарную циркуляцию крови. Инвазия трофобласта происходит под материнские спиральные артерии, которые полностью разрушаются, а плацентарный лабиринт представлен открытыми окончаниями спиральных артерий [15]. PlGF обеспечивает пролиферацию вневорсинчатого трофобласта, не оказывая влияния на процессы его миграции и инвазии. Нарушение этих процессов способствует развитию плацентарной недостаточности и задержке роста/развития плода [16, 17]. Доказано, что чем тяжелее выявленная задержка роста плода, тем ниже уровень PlGF, определяемый в крови матери [14]. В нашем исследовании относительная площадь экспрессии PlGF в плаценте женщин с нарушениями гемодинамики и задержкой роста плода была в 2 раза меньше, чем у женщин контрольной группы. А.Н. Стрижаков и соавт. (2009) установили, что при сохранных компенсаторных возможностях маточно-плацентарного звена, наблюдающихся при незначительной задержке роста плода, содержание VEGF в крови женщин не превышает физиологических показателей. При значительной задержке роста плода уровень VEGF в крови матери сначала значительно возрастает, а затем снижается (при III степени задержки), что объясняется истощением компенсаторных возможностей фетоплацентарной системы [18]. В нашем исследовании относительная площадь экспрессии VEGF в плацентах женщин с нарушениями плацентарной гемодинамики и задержкой роста плода была на 20% больше, чем у пациенток контрольной группы. В нашем исследовании выявлена корреляционная зависимость между экспрессией VEGF в центральной зоне плаценты и ИР, ПИ в маточных артериях, а также ЦПО (r₁=0,487; p₁=0,035; r₂=0,487; p₂=0,035; r₃=0,578; p₃=0,03). Установлена прямая корреляционная зависимость между экспрессией PlGF в центральной зоне плаценты и ИР в артерии пуповины (r=0,49; p=0,03). Следовательно, наши данные свидетельствуют о том, что допплерометрические параметры плацентарного кровообращения можно использовать для оценки степени морфологических расстройств сосудистой сети плаценты.

Задержке роста и развития плода сопутствует перинатальная гипоксия, являющаяся причиной возникновения перинатальных повреждений головного мозга. У каждого пятого ребёнка на первом году жизни медленно регрессируют последствия перинатальных поражений центральной нервной системы [19, 20]. Установлено, что в дальнейшем у таких детей в 2,4 раза чаще встречаются признаки минимальных мозговых дисфункций, детский церебральный паралич, двигательные нарушения и когнитивные расстройства [19, 20]. В наших предыдущих исследованиях установлено, что задержка роста и развития плода сопровождается нарушением становления цикла активность–покой [2]. Только у 1/3 та- ких плодов к 34–35 неделям беременности цикл активность–покой был сформирован, однако даже в этих случаях задерживалось его становление. Показано также, что у 7% плодов, не попавших в алгоритм Delphi протокола, цикл активность–покой отсутствовал [2]. Мы показали, что чем тяжелее были расстройства плацентарного кровообращения, тем реже у плода формировался цикл активность–покой [2]. Именно поэтому в этом исследовании мы проанализировали связь между экспрессией сосудистых факторов VEGF и PlGF и функциональным состоянием плода, оценивая координационную и интеграционную функцию ЦНС. Установлено, что у 73% плодов женщин основной группы в 34–35 недель цикл активность–покой отсутствовал, а у остальных 27% плодов спокойное состояние в цикле активность–покой было укорочено в 2 раза по сравнению с плодами контрольной группы (р=0,000). Корреляционный анализ показал, что у плодов женщин основной группы имеется обратная зависимость между площадью экспрессии VEGF и амплитудой МКР (r=–0,866; р=0,05), а также амплитудой осцилляций сердечного ритма (r=–0,866; р=0,05). При этом известно, что МКР отражает сопряжённую реакцию сердечного ритма и произвольной двигательной активности, по которой можно оценивать координационную деятельность ЦНС [21]. При гипоксии происходит угнетение функций ЦНС, что проявляется снижением амплитуды МКР и осцилляций СР.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, выявленные морфофункциональные параллели позволят разработать неинвазивные патогенетические прогностические модели пренатальной диагностики задержки развития плода при различной степени задержки его роста.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ / DISCLAIMERS

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Author contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

Финансирование. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Competing interests. The authors declares that there are no obvious and potential conflicts of interest associated with the publication of this article.

Об авторах

Шолпан Дулатовна Дюсембинова

Родильный дом № 6 им. проф. В.Ф. Снегирёва

Автор, ответственный за переписку.
Email: sholpan8-d@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9483-7335

врач ультразвуковой диагностики

Россия, 191014, г. Санкт-Петербург, ул. Маяковского, д. 5

Наталия Григорьевна Павлова

Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова»

Email: ngp05@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2886-4578

д.м.н., профессор

Россия, Санкт-Петербург

Ксения Алексеевна Кликунова

Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет

Email: kliksa@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5978-5557

к.ф.-м.н., доцент

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы