Breaking new ground: the role of molecular techniques in the detection of bacterial vaginosis

Full Text

Организм человека представляет собой холобионт, состоящий из хозяина и различных микробов, взаимосвязь между которыми усилилась за полмиллиарда лет совместной эволюции человека и микробов [1]. Информация о микробиоте холобионтов известна благодаря исследованиям, в которых для культивирования применяли культуральные методы, однако с появлением новых технологий ученые выяснили, что биоразнообразие организма далеко за рамками микробных клеток, культивируемых данным методом, а, например, метод секвенирования более детально раскрывает микробное сообщество. В последние годы все больше внимания сфокусировано на женском здоровье, особенно в отношении микробиома влагалища, содержащего миллиарды микробов, а изменения, в котором происходят в течение всей жизни женщины [2].

Бактериальный вагиноз (БВ) — это состояние, характеризующееся увеличением в 100–1000 раз концентрации факультативно или облигатно-анаэробных микробов, таких как Gardnerella, Prevotella, Atopobium, Mobiluncus, Bifidobacterium, Sneathia, Leptotrichia и др. некоторыми новыми бактериями отряда Clostridiales, называемые БВ-ассоциированными бактериями (БВ-АБ) [1, 5-6]. Показатели распространенности БВ значительно различаются между географическими регионами мира, внутри одной страны и даже среди одного и того же населения в зависимости от этнического происхождения и социально-экономического статуса. Хотя его точную распространенность по-прежнему трудно определить, БВ встречается у 4-75%, в зависимости от изучаемой популяции [7]. 

Этиология и патогенез БВ остаются предметом острых дискуссий, при этом все большее подтверждение получает концептуальная модель   патогенеза БВ, предложенная Muzny, C. A с соавт., в основе которой лежит половой путь передачи БВ-ассоциированных микроороагизмов, прежде всего – Gardnerella spp. [8]. Распространенность зависит от количества половых партнеров, и по оценкам, составляет 18,8% у не живущих половой жизнью женщин, 22,4% у женщин с одним половым партнером на протяжении всей жизни и 43,4% и 58% для женщин, имеющих 2–3 половых партнера и тех, у которых ≥ 4 половых партнера соответственно [7].

Изменения в экосистеме микробиоты влагалища могут способствовать росту G. vaginalis, тем самым нарушая баланс между полезными и условно-патогенными микроорганизмами [9]. Факторами, способствующими БВ, считают состояние гипоэстрогении, применение ежедневных гигиенических средств, курение, ранее проведенную антибиотикотерапию, некоторые методы контрацепции, такие как внутриматочные спирали, спринцевание, недостаточную активность лактобацилл, а причиной рецидивирующего БВ набор определенных факторов вирулентности [10].

Во время беременности при БВ увеличен риск самопроизвольного выкидыша, преждевременных родов, внутриутробной гибели плода, преждевременного разрыва плодных оболочек, инфекций околоплодных вод, хориоамнионита, послеабортных и послеродовых инфекций [7, 11].

Развитие БВ на ранних сроках беременности является фактором риска преждевременных родов, которые регистрируются примерно у 15 миллионов пациенток каждый год и являются основным фактором риска неонатальной смерти, или рождения ребенка с низкой массой тела при рождении [12]. 

В гинекологической практике БВ влияет на развитие эндометрита, сальпингита и инфекций мочевыводящих путей [7]. После повреждения шейки матки бактерии могут мигрировать из нижних половых путей в верхние, достигая матки и фаллопиевых труб, вызывая воспалительные заболевания органов малого таза (ВЗОМТ), постгистерэктомические инфекции и даже рак шейки матки или бесплодие трубного генеза. БВ связан со значительным повышением частоты заражения некоторых ИППП, таких как вирус простого герпеса типа 2 (ВПГ-2), вирус папилломы человека (ВПЧ), ВИЧ, а также хламидийной, гонококковой и трихомониазной инфекций [7]. 

Идентификация ассоциированных с БВ микробов при ВЗОМТ указывает на их распространение от нижних к верхним половым путям, что может быть связано с ферментами, продуцируемыми микробами, ассоциированными с БВ. Эти ферменты, такие как муциназа и сиалидаза, разрушают муциновый слой, выступающий защитным барьером, и способствуют восходящей инфекции, что приводит к ВЗОМТ [1, 7].

Вышеперечисленное подчеркивает важное значение точной и эффективной диагностики и лечения БВ, что может быть ключом к предотвращению БВ-ассоциированных патологий.

БВ является наиболее частой причиной патологических выделений с неприятным запахом из половых путей у женщин репродуктивного возраста, но может протекать и бессимптомно.

Разнообразие микрофлоры влагалища у пациенток с БВ впервые описано в 1921 г. Schröder, а наиболее распространенный микроорганизм, идентифицируемый в вагинальных образцах женщин с БВ, впервые выделен Леопольдом из мазков шейки матки женщин и мочи мужчин в 1953г., позже обнаружено, что он связан с БВ и назван H.Gardner и C.Dukes Haemophilus vaginalis в 1955 г [13, 14]. Впоследствии он был отнесен к роду Corynebacterium, а по результатам двух таксономических исследований отнесен в новый род Gardnerella и переименован в G. vaginalis [1]. C помощью полногеномного секвенирования G. vaginalis был разделен на клады, которые в работе Ahmed (2012) обозначались цифрами 1, 2, 3 и 4, соответствующие подгруппам C, B, D и A, основанным на последовательности генов cpn60 [15].

Тем не менее до 2019 г. G. vaginalis рассматривался единственным видом рода Gardnerella. Проведенный M. Vaneechoutte и соавт. анализ последовательности полных геномов 81 штамма Gardnerella дал основаниерассматривать вместо одного вида Gardnerella vaginalis существование 13 различных видов рода Gardnerella четырем, наиболее распространенным из которых были присвоены таксономические наименования: G. vaginalis (sensu stricto), G. piotii, G. swidsinskiy и G. leopoldii, [16]. Авторы показали, что ранее описанная клада 1 включает два вида, из которых один описали как G. vaginalis (s.s.), а второй вид в дальнейшем не охарактеризовался [16]. Согласно тому же исследованию, клада 2 также содержит два вида, один из которых описан как G. piotii, а другой также не определен. Клада 3 содержит три неопределенных вида, а клада 4 содержит два вида, которые они описали как G. leopoldii и G. swidsinskii.

Считается, что Gardnerella spp является ключевым игроком в прогрессировании БВ несмотря на то, что может встречаться у определенной когорты женщин без симптомов БВ. Отмечено, что при рецидивирующем БВ G. vaginalis выявляется в 100% случаев, что вызывает интерес к вопросу о том, могут ли генетические различия между патогеном влиять на развитие и рецидивы БВ [17].

Выявление Gardnerella spp отмечено у 40% клинически здоровых женщин [18]. Таким образом, колонизация Gardnerella spp не всегда способствует развитию БВ, и важно определить роль Gardnerella spp конкретном случае [7]. Вероятно, эта бактерия сама по себе необходима, но всегда недостаточна для развития БВ.

Swidsinski А. и его коллеги, используя флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH), специфичную для Gardnerella, были первыми, кто показал, что эти виды способны образовывать биопленки на эпителии влагалища у женщин с БВ, что объясняет причину наличия «ключевых клеток», то есть клеток плоского эпителия влагалища, покрытых преимущественно видами Gardnerella, и, как таковых, предоставляющих убедительные доказательства ее этиологической роли в развитии БВ [19]. В настоящее время остается открытым вопрос: все ли виды Gardnerella spp. обладают способностью образовывать биопленку, так как при других заболеваниях, где фигурирует образование биопленки, уже установлено, что не все штаммы одного и того же вида их образуют [9].

Оценка биопленкообразующей способности двух штаммов Gardnerella spp., выделенных от женщины с клиническими признаками БВ и без них, показала, что в первом случае способность к биопленкообразованию была значительно выше. Авторы исследования обнаружили, что последовательности предполагаемого гена семейства белков, ассоциированных с биопленками (BAP), весьма различаются у обоих изолятов, и это потенциально может объяснить различия в формировании биопленок [18].

Белки BAP представляют собой крупные адгезины, закрепленные на клеточной стенке, которые могут обеспечивать как адгезию к клеткам-хозяевам, так и межклеточную адгезию, способствуя тем самым образованию биопленок [20].

В совокупности эти данные подтверждают теорию развития БВ, согласно которой наличие вирулентных видов Gardnerella spp. может лежать в основе развития БВ на различных стадиях формирования биопленки [8, 21].

В другой работе А. Swidsinski и соавт. подчеркнули важность биопленки, образованной Gardnerella spp., когда заметили, что у половых партнеров женщин с БВ присутствовали только изоляты, образующие биопленки. Эти результаты приводят к предположению, что присутствие слабо прикрепившихся видов Gardnerella spp. к эпителию влагалища имеет небольшое клиническое значение и что БВ передается половым путем только при наличии скоплений высокой плотности Gardnerella spp. в биопленках [22]. Связь между генотипами Gardnerella spp и БВ неоднозначна [1]. В единственном исследовании экотипов G. vaginalis в 2017 г. были идентифицированы три экотипа в результате приобретения/утраты определенных функций генами на основе сочетания анализа филогенетической структуры [23]. В целом, это способствовало выявлению связи между G. vaginalis и различными состояниями (здоровый микробиом, бессимптомный и симптоматический БВ), тем самым в конечном итоге улучшив подходы к точной диагностике БВ.

Gardnerella spp содержит множество факторов вирулентности, связанных с ее патогенным потенциалом, из которых сиалидаза и вагинолизин наиболее широко изучаемы [1].

Сиалидаза осуществляет гидролиз остатков сиаловой кислоты из сиалогликанов слизи во влагалище, а затем катаболизирует свободные углеводы, тем самым способствуя разрушению слизистых барьеров влагалища [1]. Примечательно, что некоторые виды Gardnerella, в том числе G. swidsinskiy, G. leopoldii и определенная подгруппа G. vaginalis, обладают отрицательной сиалидазной активностью [16]. Также ген сиалидазы А ассоциирован с БВ и формированием биопленки [16]. Что касается вагинолизина, то он способствует лизису клеток-мишеней, таких как эпителий влагалища [1]. Другие факторы вирулентности, такие как пролидаза и гликосульфатаза, также связаны с БВ [1].

В целом, все эти исследования подтверждают гипотезу о том, что некоторые представители рода Gardnerella с меньшей вероятностью вызывают БВ, тогда как другие более вирулентны и с более склонны к развитию БВ [9].

Существуют две основные категории диагностических стратегий для БВ: «прикроватный» метод, введенный в 1983 г., в основном основанный на клинических критериях в режиме амбулаторного приема – «критериях Амселя», и лабораторное исследование, разработанное в 1991 г., опираясь на оценку морфотипов по микроскопической картине препарата, окрашенного  по Граму – «шкала Ньюджента» [24, 25]. Критерии Амселя используются для клинической диагностики, и для подтверждения диагноза требуется по крайней мере 3 из следующих 4 характеристик: наличие гомогенных или молочных выделений из половых путей, повышенный рН влагалища, рыбный запах и наличие ключевых клеток (влагалищных эпителиальных клеток, покрытых бактериями) с помощью микроскопии [24]. Тем не менее, в некоторых случаях вышеперечисленные характеристики часто отсутствуют, и соответствующий диагноз несколько субъективен [1].

Шкала Ньюджента основана на количественном анализе морфотипов различных микроорганизмов, таких как Lactobacillus и G.vaginalis (s.l.), в окрашенных по Граму мазках из влагалища, где используется система баллов, в которой баллы 0–3, 4–6 и 7–10 считаются нормоценозом, промежуточным типом мазка и БВ соответственно [25]. Критерии Амселя и шкала Ньюджента являются наиболее распространенными методами диагностики БВ, а Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) считает шкалу Ньюджента золотым стандартом исследований, хотя последняя имеет свои подводные камни [1].

Фактически, промежуточная флора пока является не охарактеризованной категорией и проблемой в диагностике БВ. Кроме того, идентификация морфотипов субъективна и зависит от индивидуальных навыков и опыта [1].

Для диагностики БВ могут использоваться различные диагностические подходы, и врачам-клиницистам следует выбирать приемлемый метод в зависимости от времени, стоимости и точности.

Так как присутствие сиалидазы в настоящее время считается ключевым показателем БВ, разработан ферментативный подход: тест OSOM BVBlue, который основан на качественном обнаружении высокого уровня сиалидазы, продуцируемой анаэробными патогенами, в образцах выделений влагалища. Доказана его надежность по сравнению с традиционными методами, такими как критерии Амселя и шкала Ньюджента [1].

Кроме того, недавнее исследование, проведенное Liu и соавт. в 2018г., показало преимущество метода флуоресценции в качестве инструмента для диагностики БВ, основанного на изменение интенсивности светового сигнала с относительной концентрацией сиалидазы в образце выделений. Тест обладает чувствительностью и специфичностью 95,40% и 94,94% соответственно по сравнению с методом Амселя и 92,5% и 91,8% по сравнению с результатами диагностики BVBlue. Кроме того, этот метод более точно классифицирует БВ и оценивает тяжесть заболевания на основе относительной интенсивности флуоресценции (I/I0), и может быть потенциальным инструментом для диагностики БВ на основе уровней активности сиалидазы [26].

Другой новый подход, основанный на иммунодетекции, также нацеленный на сиалидазу, был разработан для диагностики БВ. Нанофотонный принцип работы этого метода биодетекции позволяет проводить более дешевый, быстрый и простой анализ, чем непрямой твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Данная нанотехнология обладает высокой чувствительностью и специфичностью (96,29% соответственно). Этот метод предлагает оригинальный подход к очень быстрой диагностике БВ [7].

Учитывая ограничения вышеупомянутых методов диагностики БВ, фокус внимания в последние годы сосредоточен на методах молекулярной диагностики, которые позволяют обнаруживать и количественно определять ДНК Lactobacillus spp. и микроорганизмов, ассоциированных с БВ – в первую очередь  таких бактерий, как Gardnerella spp, A. vaginae, BVAB, Leptotrichia/Sneathia spp.,Megasphaera spp. и Mobiluncus spp. и др. [27]. Lamont R. и соавт. показали, что молекулярно-генетические методы диагностики демонстрируют более высокую чувствительность в сравнение с диагностическими методами, являющимися золотым стандартом.

Однако в тестирование необходимо отражать как маркеры нормоценоза, такие как L. Crispatus, так и БВ, таких как Gardnerella spp, A. vaginae, а также разработать и количественный, и качественный анализ. Кроме того, важно не забывать о редко встречающихся микроорганизмах, роль которых в развитии БВ остается неизвестной, и продолжить их изучение [27].

В РФ был проведен целый ряд исследований, направленный на изучение возможности применения метода ПЦР для диагностики БВ.  В работе Шалепо К.В. и соавт. в 2014г. обследовании 222 женщин показано, что качественное определение G. vaginalis с помощью ПЦР имеет низкое прогностическое значение положительного результата для диагностики БВ, в данном случае гораздо  важнее определять ее концентрацию  [28].

В методике, разработанной и запатентованной Гущиным А.Е. с соавт. были определены молекулярно-биологические критерии (соотношение концентраций ДНК G. vaginalis (s.l.), A.vagineae и Lactobacillus spp. и ДНК общего количества бактерий) позволяющие идентифицировать  состояние, соответствующее  БВ. Высокие диагностические характеристики разработанной методики для выявления БВ были подтверждены в целом ряде зарубежных исследований относительно как классических методов (критериев Амселя и микроскопии с баллами по Ньюдженту), так и относительно других молекулярно-биологических методов. [29, 30]

На основе указанной методики были разработаны наборы реагентов для диагностики БВ АмплиСенс-Флороценоз (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва) и АмплиПрайм-ФЛОРОСКРИН (ООО «НекстБио»).

Полученные к настоящему времени данные по генетической гетерогенности гарднерелл, новая таксономия, подтверждающая существование значительного числе видов и разная представленность факторов вирулентности среди описанных видов Gardnerella определили значительный интерес к возможности гено-видо- типирования в рамках клинико-лабораторного определения герднерелл.  

Balashov S. и соавт., используя новый молекулярный подход, провели сравнительный анализ, способный идентифицировать и количественно оценить подтипы G. vaginalis, изучив образцы отделяемого влагалища 60 женщин. Выявлено, что высокая распространенность патогенов в 100% случаев наблюдалась у пациенток с БВ, и в 97% случаев у здоровых женщин. Наличие клада 1 отмечено у 53% пациенток, клада 2 у 25%, а клада 3 и 4 у 32 % и 83 % соответственно. Несколько клад были обнаружены в 70% образцов. Отмечено, что 1 и 3 клады положительно коррелируют с развитием БВ. Кроме того, авторы показали, что изоляты, проявляющие недостаточную сиалидазную активность, более распространены среди здоровых женщин [31].

Е. Шипицына и соавт. охарактеризовали микробиоту 299 женщин и показали, что количественная оценка всех четырех клад G. vaginalis различает микробиоту при БВ и нормальную микробиоту более точно, чем измерение гена G. vaginalis sialidase A, а клад 4 тесно связан с микробиотой БВ, несмотря на то, что большинство штаммов этого клада не имеют гена сиалидазы А [32].

Крысанова А. и соавт. в 2021г. исследовали 299 женщин и показали, что у 38,2% здоровых женщин в вагинальном биотопе выявляется какой-либо генотип G. vaginalis, чаще всего генотип 4 (35,2%), при этом концентрация ДНК G. vaginalis низкая (10²-10³ГЭ/мл). При выявлении нескольких генотипов гарднерелл одновременно у здоровых женщин концентрация ДНК не превышала 10⁴ ГЭ/мл. Иная картина наблюдалась у пациенток с БВ. При первом эпизоде БВ превалировал 4-й генотип G. vaginalis как в качестве единственного генотипа, так и в сочетании с 1-м, или 2-м, или 3-м. При рецидивирующем течении БВ выявлялись исключительно сразу 3–4 генотипа G. vaginalis, причем в 78% случаев наблюдалось сочетание 1-го, 2-го и 4-го генотипов, а концентрация ДНК составляла 10⁷-10⁸ГЭ/мл. [33]

Таким образом таксономический и бактериальный составы микробиоты влагалища находятся под влиянием внутренних и внешних факторов на протяжении всей жизни женщины. В последние десятилетия понятие бактериального разнообразия этой экосистемы расширилось с помощью молекулярных методов. Микрофлора влагалища здоровых женщин, в которой преобладают лактобациллы, защищающие от инфекции, менее сложна, чем при БВ, представляющая собой разнообразную микробиоту, содержащую многочисленные облигатные анаэробные и некультивируемые виды. Это полимикробное состояние связано с относительно несложными клиническими симптомами, которые встречаются не у всех предъявляющих жалобы женщин, что затрудняет определение его этиологии. Лечение обычно безуспешно, с высокой частотой рецидивов. Необходимы будущие исследования, которые тщательно изучат вагинальное бактериальное сообщество, чтобы культивировать бактерии, связанные с БВ и неэффективностью его лечения, чтобы изучить устойчивость к антибиотикам и установить более эффективные альтернативные терапевтические стратегии, которые уменьшают симптомы БВ, а также связанные с ним осложнения. В целом, изучение патогенеза БВ является ключом к профилактике и лечению этой проблемы общественного здравоохранения.

Заключение

Генотипирование представляет собой мощный инструмент в диагностике БВ, обеспечивая точные и быстрые результаты. Оно способствует не только улучшению диагностики, но и углубленному пониманию патогенеза нарушения в микробиоме, что в свою очередь позволяет разработать более эффективные стратегии его лечения и профилактики. Дальнейшие исследования в этой области необходимы для оптимизации применения генотипирования в клинической практике.

Понимание роли генотипов G.vaginalis в микробиоте влагалища имеет важное значение для диагностики и лечения различных гинекологических заболеваний. Дальнейшие исследования необходимы для разработки эффективных методов поддержания микробной экосистемы и профилактики дисбиоза во влагалище.

Знание генотипа микроорганизмов у конкретной пациентки даст возможность врачам адаптировать терапию с учетом индивидуальных особенностей её микробиоты.

Сегодня важно использовать метод ПЦР для диагностики ДНК бактерий и классифицировать их по биологическим свойствам.  Это позволит дифференцированно и бережно подходить к восстановлению биоценоза влагалища, проводить лечение БВ и осуществлять профилактические мероприятия именно в тех наблюдениях, где это действительно необходимо.

About the authors

Valeriya D. Kazantseva

Pirogov Russian National Research Medical University

Author for correspondence.
Email: shapee08@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4011-3195
SPIN-code: 6973-6276

Russian Federation, Moscow

Alexander Evgenievich Gushchin

Moscow Scientific and Practical Center of Dermatovenereology and Cosmetology DZM

Email: aguschin1965@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0399-1167

Candidate of Biological Sciences, Leading Researcher, State Budgetary Institution of Healthcare "MNPTSDC DZM"

Russian Federation, 119071, Russia, Moscow, Leninsky Prospekt, 17

Yulia E. Dobrokhotova

N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Ministry of Health of Russia

Email: pr.dobrohotova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7830-2290
SPIN-code: 2925-9948

Dr. Med. Sci., Professor, Head of the Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine

Russian Federation, Moscow

Lyudmila A. Ozolinya

Pirogov Russian National Research Medical University

Email: ozolinya@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2353-123X
SPIN-code: 9407-9014

Russian Federation, Moscow

Tatyana N. Savchenko

N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Ministry of Health of Russia

Email: 12111944t@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7244-4944

Dr. Med. Sci., Professor at the Department of Obstetrics and Gynecology

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files