POLYMORPHISM OF SOME GENES IN PATIENTS WITH CHRONIC ENDOMETRITIS

Full Text

Введение В настоящее время лечение бесплодия является важной проблемой. Причин роста числа инфертильных пар много, в том числе наблюдается увеличение доли маточного фактора нарушения репродукции как одной из плохо поддающейся диагностическому изучению и соответственно лечению причин. Роль хронического эндометрита (ХЭ) в нарушении фертильности как причины невынашивания и неудачных попыток вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) уже не оспаривается, происходят неудачи при имплантации. Хронический эндометрит изучают многие направления медицины - анализируются микробиологические факторы хронического воспаления, морфологические критерии ХЭ, иммунология невынашивания и т. д. Каждое направление вносит свой вклад в понимание нормы и патологии процессов в эндометрии, однако в аспектах диагностики, лечения и прогнозирования ХЭ многое остаётся неясным: отсутствие инфекционного агента при культуральном исследовании проб эндометрия затрудняет определение дальнейшей тактики ведения пациенток с подозрением на ХЭ. Расхождение морфологических критериев ХЭ в образце ткани эндометрия больной у разных морфологов также вызывает вопросы о дальнейшей диагностической и лечебной тактике ведения пациентки и т. д. В последнее время определённый интерес вызывает транскриптомный анализ как диагностический инструмент в изучении эндометрия. На протяжении многих лет гистологические критерии, установленные ещё R.W. Noyes в 1950 г. [1], считались «золотым стандартом» для оценки эндометрия, однако в настоящее время только определение секреторной трансформации эндометрия [2, 3] не может объяснить причину бесплодия, гистологическая верификация всего лишь фаз менструального цикла не позволяет определить функциональную активность и рецептивность эндометрия. Много лет рецептивность эндометрия изучали с разных точек зрения: описывали разные маркеры её состояния (морфологические и биохимические, молекулярные и клеточные механизмы и т. д.), однако ни один из изучаемых маркеров пока не является общепризнанным диагностическим критерием, так как обладает низким прогностическим значением [4-11]. Необходимость создания более точных и объективных методик исследования эндометрия очевидна, особенно интересным является понимание генетического механизма, лежащего в основе его гистологических изменений. Впервые A.P. Ponnampalam и соавт. [4] предложили использовать транскриптомный анализ для выявления тех аномалий, которые невозможно определить с помощью гистологического исследования эндометрия. Перспективные открытия касаются роли экспрессии генов в формировании бесплодия [6, 12-14], исследователи сосредоточились на поиске разных маркеров рецептивности эндометрия: интегринов, муцинов и цитокинов, моноаминоксидазы и разных генов - C4BPA, CRABP2 [14-20] и др. Многие авторы пишут о роли генов в регуляции функционирования эндометрия (в том числе генов, участвующих в процессе апоптоза). Исследования D. Carson и соавт. [20], L. Kao и соавт. [21], J. Borthwick и соавт. [22], A. Riesewijck и соавт. [23] и S. Mirkin и соавт. [24] показали, что гены VEGF, LIF могут иметь отношение к процессу имплантации в матке. В другой научной работе [25] J. Horcajadas и соавт. пытались составить список генов, имеющих отношение к рецептивности эндометрия. Было проведено сравнение результатов 3 различных образцов ткани: образцы эндометрия в естественном цикле, в стимулированном цикле и при наличии внутриматочных контрацептивов (ВМС); в процессе данной работы найдено 25 генов, которые могут регулировать период «окна имплантации», кроме этого, полученные результаты показали, что некоторые гены могут находиться в состоянии дисрегуляции при стимуляции овуляции и при наличии ВМС. Выделены гены, которые однозначно отвечают за рецептивность эндометрия, например, гликоделин, LIF, α-катенин. В другой работе M. Ruiz-Alonso и соавт. предложили разработанную ими методику «Endometrial Receptivity Array (ERA)» - транскриптомный анализ эндометрия во всех фазах менструального цикла; методика также была описана в работе P. Diaz-Gimeno и его коллег [26]. Суть её в том, что имеется совокупность 238 генов, имеющих разную экспрессию в разных фазах менструального цикла; 134 гена могут быть маркерами рецептивной восприимчивости эндометрия. Надо отметить, что транскриптомные технологии достаточно сложны для классификации изменений в ткани эндометрия в различные фазы менструального цикла, дорогостоящи и пока трудновоспроизводимы (для их выполнения нужен обученный персонал). Наше внимание привлекли особенности полиморфизма генов VEGF rs2010963 (фактор роста эндотелия сосудов), NO-синтазы 179998 (eNOS), ApoE rs429358 (ген аполипопротеина E), ESR12228480 (ген рецептора эстрогена 1), ММР9-17576 (металлопротеиназа), PPARGC1A 8192678 (1-α-коактиватор гамма-рецептора, активируемого пролифератором пероксисом) и их экспрессии у больных с ХЭ и у практически здоровых женщин. По мнению одних авторов, сниженная экспрессия ангиогенных факторов - фактора роста эндотелия сосудов VEGF - может быть причиной бесплодия, возможно, из-за дефектного фетального и плацентарного ангиогенеза [27]; полиморфизм PPARGC1A опосредованно может приводить к изменению секреции инсулина (в нормальной экспрессии - повышает) и катаболических воздействий на жировую массу, а также подавлять (в нормальной экспрессии - стимулирует) образование митохондрий и окислительные процессы, нарушать регуляцию глюконеогенеза и транспорта глюкозы в клетку [28]; молекулы NO непрерывно продуцируются ферментативным путём в организме человека, участвуя в основных процессах клеточного метаболизма [29]; ММР9 как полифункциональные белки участвуют в механизмах ангиогенеза и апоптоза [30]; ApoE играет важную роль при захвате холестерола и в стероидогенезе, его генетическая изменчивость может быть связана и с нарушением репродуктивной функции; изменчивость генов эстрогеновых рецепторов ESR может привести к бесплодию [31, 32]. Цель исследования - изучить встречаемость полиморфизмов в промоторных участках генов VEGF rs2010963, ApoE rs429358, ESR1 2228480, PPARGC1A 8192678, ММР9 17576 и eNOS 1799983 у женщин с хроническим эндометритом и сравнить с показателями практически здоровых женщин. Материал и методы Проведённое исследование имело характер клинического, аналитического, проспективного анализа. Обследованы 75 женщин репродуктивного возраста, из них сформированы 2 группы: 1-ю составили практически здоровые женщины (n = 33), обратившиеся с целью подбора контрацептивных средств, во 2-ю группу вошли пациентки с хроническим эндометритом (n = 42) (диагноз верифицирован путём морфологического исследования). Критериями включения женщин в исследование было отсутствие острой или обострения хронической соматической патологии, а также признаков обострения хронической воспалительной патологии органов малого таза (хронического сальпингита, оофорита, эндометрита, цервицита, вагинита). Комплексное обследование пациенток включало: общее клиническое и гинекологическое обследование, анализ общеклинических лабораторных показателей, статистические методы. В качестве праймеров использовали участок ДНК генов VEGF rs2010963 (G634C), ApoE rs429358(Cys130Arg), ESR1 2228480 (Thr594Thr), PPARGC1A 8192678(Gly482Ser), ММР9 17576(Gln279Arg) и eNOS 1799983(Glu298Asp). Для исследования полиморфных вариантов изучаемых генов применяли методику полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, при анализе подсчитывали процент гомозигот и гетерозигот. Забор материала для ПЦР проводили методом взятия мазков со слизистой оболочки ротоглотки. Для определения генотипа человека применялся метод аллельной дискриминации, когда различия между гетерозиготами, гомозиготами дикого и минорного вариантов устанавливали по различиям в протекании реакций амплификации соответствующих праймеров. Возможных вариантов состояния гена было два: гомозиготное - в случае, когда одно из значений порогового цикла не определяется (ниже пороговой линии), и гетерозиготное - в случае, когда получено два значения пороговых циклов и по этим каналам построены параболические кривые флуоресценции [33]. В зависимости от того, накопление какого продукта амплификации происходило в реакции, устанавливалось гомозиготное нормальное или минорное состояние гена. Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «ПГМУ им. акад. Е.А. Вагнера» Минздрава России (протокол № 6 от 26.05.2016 г.), все пациенты подписали информированное согласие. В данном исследовании отсутствовал конфликт интересов и не было дополнительных источников финансирования, которые могли бы повлиять на его исход. Для анализа взаимосвязей между частотами встречаемости признака в группе использовали критерий χ2, результаты рассчитывали в виде оценки доли признака (Q) с 95% доверительным интервалом Q ± q, анализ межгрупповых различий по частотам встречаемости признаков также выполнен с применением критерия χ2, отношения шансов (ОШ) с доверительным интервалом (ДИ) 95%. Результаты и обсуждение Средний возраст женщин составил в 1-й группе 30,90 ± 7,09 года, во 2-й - 34,11 ± 4,79 года. В 1-й группе 10 (30,3 ± 16,3%) женщин имели избыточную массу (по индексу массы тела) и ожирение 1-й степени (χ2 = 9,55; p = 0,002), во 2-й группе - 13 женщин с нарушением жирового обмена (30,95 ± 14,41%) (χ2 = 13,11; p < 0,001). Между группами практически здоровых и больных женщин обнаружены статистически незначимые различия частот встречаемости таких признаков, как нарушение веса (χ2 = 0,037; p = 0,848, ОШ 1,031; 95% ДИ 0,38-2,77) и хронический панкреатит (χ2 = 1,861; p = 0,172; ОШ 3,125; 95% ДИ 0,78-12,46). При сравнении пациенток 1-й и 2-й группы выявлены статистически значимые различия между частотами встречаемости таких заболеваний, как хронический гастрит - в 1-й группе болели 12 ± 11,92%, во 2-й группе - 57,14 ± 15,42% (χ2 = 13,550; p = 0,001; ОШ 9,333; 95% ДИ 2,78-31,39); функциональные заболевания кишечника - в 1-й группе болели 3,03 ± 6,08%, во 2-й группе - 64,29 ± 14,93% (χ2 = 27,078; p = 0,001; ОШ 57,600; 95% ДИ 7,14-464,79); болезни жёлчного пузыря - в 1-й группе 3,03 ± 6,08%, во 2-й группе - 61,9 ± 15,1% (χ2 = 25,305; p = 0,001; ОШ 52,000; 95% ДИ 6,46-418,55); болезни мочевыделительной системы - в 1-й группе не отмечено, во 2-й группе - 50 ± 15,58% (χ2 = 12,237; p = 0,001); хронический назофарингит - в 1-й группе у 6,06 ± 8,46%, во 2-й группе - 28,27 ± 14,08% (χ2 = 4,774; p = 0,029; ОШ 6,200; 95% ДИ 1,28-30,07). Надо отметить, что указанные заболевания значительно чаще отмечались у пациенток с ХЭ. Сравнительная характеристика частоты описанных выше патологий отражена на рисунке. Анализ акушерско-гинекологического анамнеза показал, что имеются статистически значимые различия между частотой встречаемости медицинского аборта, хронического аднексита и сальпингита, хронического цервицита, неразвивающейся беременности в анамнезе и бесплодия - эти показатели выше у женщин с ХЭ (табл. 1). При анализе внутригрупповых различий по полиморфизму в изучаемых промоторных участках генов обнаружено, что в группе практически здоровых женщин (1-я группа) распространён полиморфизм генов: MMP9 17576 (Gln279Arg) - гомозиготный вариант полиморфизма отмечен у 4 (12,1%) женщин, гетерозиготный - у 14 (42,4%) (p < 0,001); VEGF rs2010963(G634C) - гетерозиготный вариант полиморфизма отмечен у 13 (39,4%) обследуемых (p < 0,001); ApoE rs429358 (Cys130Arg) - гетерозиготный вариант полиморфизма - у 11 (33,3%), и патологический гомозиготный - у 1 (3,03%) пациентки (p < 0,003); гетерозиготный вариант полиморфизма PPARGC1A 8192678(Gly482Ser) выявлен у 11 (33,3%) женщин, патологический гомозиготный - у 3 (9,09%) (p < 0,001); гетерозиготный вариант полиморфизма eNOS 179998(Glu298Asp) отмечен у 6 (18,2%) женщин, патологический гомозиготный - у 3 (9,1%) (p = 0,036); полиморфизм гена ESR1 2228480(Thr594Thr) (гетерозиготный вариант) выявлен только у 1 (3,03%) пациентки. При анализе внутригрупповых различий по полиморфизму генов в группе больных с ХЭ (2-я группа) обращает на себя внимание значимое распространение полиморфизма MMP9 17576(Gln279Arg) - носителями патологической гомозиготы были 8 (19%) женщин и гетерозиготного полиморфизма - 21 (50%) пациентка (p < 0,001); VEGF rs2010963(G634C) - патологический гомозиготный вариант отмечен у 5 (11,9%) пациенток, гетерозиготный - у 13 (30,9%) больных (p < 0,001); ApoE rs429358(Cys130Arg) - гетерозиготный вариант полиморфизма гена выявлен у 21 (50%) пациентки, патологический гомозиготный - у 2 (4,8%) женщин (p < 0,001); ESR1 2228480 (Thr594Th) - носителем патологической гомозиготы была 1 (2,38%) пациентка, гетерозиготного варианта - 9 (21,4%) больных (p < 0,001); eNOS 179998 (Glu298Asp) - патологический гомозиготный вариант полиморфизма отмечен у 3 (7,1%) и гетерозиготный - у 23 (54,8%) больных (p < 0,001); гетерозиготный вариант полиморфизма PPARGC1A 8192678 (Gly482Ser) имелся у 12 (28,6 ± 14%) пациенток, патологический гомозиготный - у 5 (11,9 ± 10,0%) больных (p < 0,001). Данные распределения частот гетерозиготного и гомозиготного генотипа, нормальной и патологической аллели в группах отражены в табл. 2. При сравнении группы практически здоровых женщин и больных с ХЭ выявлены статистически значимые различия между частотами встречаемости признаков полиморфизма гена eNOS 179998(Glu298As) и ESR1 2228480(Thr594Thr): в группе с ХЭ 26 (61,9%) больных имели патологический гомозиготный или гетерозиготный вариант полиморфизма eNOS 179998(Glu298Asp), в группе практически здоровых пациенток выявлено только 9 (27,3%) таких случаев (χ2 = 7,568; p = 0,006; ОШ 4,333; 95%ДИ 1,61-11,63); патологические изменения по полиморфизму гена ESR1 2228480(Thr594Thr) в группе с ХЭ выявлены у 10 (23,8%) больных, а в группе практически здоровых - только у 1 (3,03%) пациентки (χ2 = 4,823; p = 0,028; ОШ 10,0; 95% ДИ 1,21-82,75). Распространённость патологической гомозиготы по гену eNOS 179998(Glu298Asp) в группах больных с ХЭ и практически здоровых составила 7,5 и 9,1% соответственно, однако распространённость мутантного аллеля T в них составила 34,5 и 18,2% (p = 0,001). Распространённость патологического гомозиготного полиморфизма гена ESR1 2228480(Thr594Thr) в группе с ХЭ отмечена у 2,4% пациенток, в группе практически здоровых женщин - 0%, однако распространённость мутантного аллеля A в них составила 13,1 и 1,5% соответственно (p = 0,001). Статистически группы не различались по следующим признакам: полиморфизм гена VEGFA (разные варианты патологических изменений) имелся у 13 (39,4%) практически здоровых женщин и у 18 (42,9%) больных с ХЭ (χ2 = 0,004; p = 0,947; ОШ 1,154; 95% ДИ 0,46-2,92), полиморфизм гена PPARGC1A обнаружен у 14 (42,4%) больных с ХЭ и у 17 (40,4%) практически здоровых женщин (χ2 = 0,004; p = 0,947; ОШ 0,923; 95% ДИ 0,37-2,33), полиморфизм гена MMP9 (разные варианты патологических изменений) выявлен в группе с ХЭ у 18 (54,5%) больных и у 29 (69,0%) практически здоровых пациенток (χ2 = 1,099; p = 0,294; ОШ 1,859; 95% ДИ 0,72-4,79), полиморфизм гена ApoE - у 12 (36,6%) практически здоровых и у 23 (54,7%) больных с ХЭ (χ2 = 1,828; p = 0,176; ОШ 2,118; 95% ДИ 0,83-5,39). Заключение При сравнении результатов обследования практически здоровых женщин и больных с ХЭ выявлены статистически значимые различия между частотой встречаемости не только гинекологической, но и хронической соматической патологии - женщины с ХЭ болеют чаще. На основании полученных результатов можно предположить, что у пациенток с хроническим эндометритом чаще встречается полиморфизм генов, отвечающих за ангиогенез, окислительные процессы в организме и метаболизм. В частности, отметим статистически значимое преобладание полиморфизма в промоторных участках генов eNOS и ESR1 у больных с ХЭ, что предположительно может свидетельствовать о негативных генетических ассоциациях с нарушением фертильности, хотя данный вопрос требует дальнейшего изучения. Также у пациенток с ХЭ обнаружены патологические ассоциации в экспрессии генов локусов ApoE, PPARGC1A, MMP9, VEGF, что, возможно, имеет отношение к сочетанному эффекту влияния на формирование разных патологических изменений в организме. Заслуживает внимания обнаружение полиморфизма генов MMP9, VEGF, PPARGC1A и ApoE у женщин, не болеющих ХЭ; вопросы наличия у группы практически здоровых женщин генетического полиморфизма генов MMP9, VEGF и ApoE и более низкой частоты соматической и гинекологической патологии требуют дальнейшего изучения. В перспективе изучение маркирования чувствительных генетических показателей может быть основой создания критериев комплексной оценки формирования соматической и гинекологической патологии у женщин в условиях воздействия дополнительного негативного фактора (механического, инфекционного, лекарственных препаратов, экопатогенов и т. д.).

About the authors

Ekaterina G. Kobaidze

Acad. E.A. Wagner Perm State Medical University

Email: eka7i@yahoo.com
MD, PhD, Associate professor of the Acad. E.A. Wagner Perm State Medical University, Perm, 614000, Russian Federation Perm, 614000, Russian Federation

M. M Padrul

Acad. E.A. Wagner Perm State Medical University

Perm, 614000, Russian Federation

References

Supplementary files