Profile features immunohistochemical endometrium in patients uterine form of infertility

Full Text

Женское бесплодие, частота которого, согласно данным мировой статистики, варьирует в пределах 8- 18%, не имеет тенденции к снижению и остается одной из важнейших проблем современной медицины [1-8]. При этом маточный фактор занимает одно из ведущих мест в структуре бесплодия, достигая 50%, наряду с трубно-перитонеальным фактором (70%) и эндо- метриозом (46,5%)[9, 10]. В основе патогенеза бесплодия при внутриматочной патологии лежит нарушение процессов имплантации эмбриона на стадии бластоцисты в середине лютеиновой фазы менструального цикла [11]. Для уточнения патогенетических механизмов в настоящее исследование помимо стандартных методов диагностики мы включили изучение иммуногистохи- мического профиля эндометрия у пациенток с маточной формой бесплодия. Цель исследования - комплексная оценка состояния эндометрия у женщин с маточной формой бесплодия с использованием морфологических и иммуноги- стохимических методов. Материал и методы В клинике акушерства и гинекологии им. В.Ф. Снегирева Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова за период 2012-2016 гг. проведено обследование 79 женщин с нарушением репродуктивной функции в возрасте 24-43 лет. Пациенток разделили на 4 группы в зависимости от характера внутриматочной патологии: 1-ю группу составили 33 женщины с гиперплазией эндометрия, 2-ю группу - 20 пациенток с внутриматочными синехиями, 3-ю - 19 женщин с хроническим эндометритом. В 4-ю группу вошли 7 пациенток с нормальной гистероскопической, морфологической и иммунологической картиной эндометрия. Критерием включения в исследование являлось отсутствие беременности при регулярной половой жизни без контрацепции в течение 1 года и более у пациенток с внутриматочной патологией. Комплексное обследование подразумевало общеклинические (клиническое и биохимическое исследование крови, гемостазиограмма, общий анализ мочи, микроскопическое и бактериологическое исследование флоры из цервикального канала и влагалища) и инструментальные методы диагностики (кольпоскопия, гистеросальпингография, трансвагинальная эхография органов малого таза, гистероскопия, биопсия эндометрия с последующими морфологическим и иммуноги- стохимическим исследованием соскобов). Трансвагинальную эхографию осуществляли на ультразвуковом аппарате «Toshiba SSH-140A» с кон- вексным и трансвагинальным датчиками с частотой 6,5 МГц. При этом оценивали размеры матки, структуру и толщину эндо- и миометрия, величину и эхострук- туру яичников, размеры функциональных образований (желтых тел и фолликулов). При наличии патологических образований оценивали размеры, количество, локализацию, структуру и эхогенность. Всем пациенткам с подозрением на внутриматоч- ную патологию производили «офисную» гистероскопию на 5-9-й день менструального цикла без применения пулевых щипцов и расширения цервикального канала, используя офисные гистероскопы со световолоконной оптикой фирм «Karl Storz» и «Rudolf» (Германия), диаметром 2,7 мм. Оценивали форму цервикального канала и полости матки, состояние эндоцервикса, эндометрия и устьев маточных труб. Гистеросальпингографию проводили 52 пациенткам с целью уточнения состояния маточных труб. Морфологическое исследование биоптатов и соско- бов эндометрия выполняли в межклинической лаборатории молекулярных методов диагностики Первого Московского государственного медицинского универ- Original papers ситета им. И.М. Сеченова. Биоптаты и соскобы слизистой оболочки полости матки фиксировали в 10% за- буференном (фосфатном) нейтральном формалине и заливали в парафин. Суммарное время фиксации и заливки материала не превышало 24 ч. Затем из каждого блока делали не менее 10 ступенчатых срезов толщиной 4 мкм с последующей окраской гематоксилином и эозином. В окрашенных препаратах оценивали состояние желез эндометрия и стромы, наличие фиброза, воспалительной инфильтрации, количество и диаметр спиральных артерий, толщину их стенок. Для иммуногистохимического исследования применяли двухэтапный с демаскировкой антигена стреп- тавидин-биотин-пероксидазный метод с использованием стандартных наборов моноклональных антител фирмы «DAKO». Определяли следующие иммуноги- стохимические маркеры: рецепторы к эстрадиолу и прогестерону, Ю-67, CD34, CD56, CD68, CD138, VEGF. Проявление реакции осуществлялось системой визуализации Dako Cytomation. Для выявления первичных антител использовали безбиотиновую систему детекции «Super Sensitive Polymer-HPR Detection System» («Biogenex», США). Результаты реакции рецепторов к эстрадиолу и прогестерону идентифицировали по ядерному или мембранному окрашиванию клеток для соответствующих маркеров с оценкой процента окрашенных клеток и интенсивностью окраски. Экспрессию рецепторов к эстрадиолу и прогестерону оценивали по 3-балльной шкале (слабая, средняя и выраженная). Для определения уровня экспрессии антигена Ki-67 в железах подсчитывали индекс пролиферации - отношение количества окрашенных ядер к общему числу ядер в % не менее чем в 300 клетках. Экспрессию Ki-67 в строме оценивали путем подсчета количества окрашенных ядер в поле зрения при 400-кратном увеличении, изучая не менее 10 полей зрения. Экспрессию CD34 и VEGF определяли в эпителии, строме эндометрия и в эндотелии сосудов. Активность проявлялась в виде окрашивания мембраны и цитоплазмы эпителиальных и эндотелиальных клеток. Результаты оценивали полуколичественно, по общепринятой методике: (+) - до 20% положительных клеток - 2 балла; (++) - 20-40% положительных клеток - 4 балла; (+++) - больше 40% положительных клеток - 6 баллов. Экспрессию CD56, CD68, CD138 определяли путем подсчета позитивных клеток в поле зрения при 400-кратном увеличении в 10 полях зрения. Статистическая обработка материала проводилась с использованием стандартной программы Microsoft Excel 2010 с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (p). Результаты и обсуждение Проведено комплексное обследование 79 пациенток в возрасте 24-43 лет с нарушением репродуктивной функции, 43 (54,4%) из них страдали первичным бесплодием, а 36 (45,6%) - вторичным. Длительность бесплодия составила соответственно 5,4 ± 0,5 и 7,3 ± 0,6 года. При изучении акушерско-гинекологического анамнеза выявлено, что только у 18 (50%) из 36 пациенток с вторичным бесплодием в анамнезе имелись роды При этом одни роды имели место у 11 (66,1%) из них, двое родов - у 7 (38,9%). Искусственное прерывание беременности выполнено у 23 (63,9%) женщин, причем у 15 из них более двух раз. Самопроизвольные выкидыши в прошлом отмечены у 12 (33,3%) женщин, из них у 8 - более трех раз. У всех пациенток с первичным и вторичным бесплодием в анамнезе имели место гинекологические оперативные вмешательства, частота которых представлена на рисунке 1. Осмотр шейки матки в зеркалах и расширенная кольпоскопия в 10 (12,7%) наблюдениях позволили выявить рубцовую деформацию шейки матки, в 12 (15,2%) случаях - цервикальную эктопию. Гистеросальпингография (ГСГ) произведена у 64 (81%) из 79 пациенток, остальных обследовали по поводу бесплодия ранее в отделениях ВРТ перед ЭКО и ПЭ. У 21 (31,3%) из 64 женщин ГСГ выявила дефект наполнения полости матки от частичной до полной облитерации, что позволило диагностировать наличие внутриматочных синехий. При трансвагинальной эхографии, которую проводили в первую фазу менструального цикла, у большинства пациенток отмечалась повышенная эхогенность, неоднородность структуры эндометрия с множественными мелкими анэхогенными включениями. При офисной гистероскопии у 33 (41,8%) женщин определяли неравномерно утолщенную слизистую оболочку с выраженным сосудистым рисунком, устья маточных труб визуализировались. У 7% пациенток полость матки была облитерирована полностью, вну- триматочные синехии, деформировавшие 2/3 полости, выявлены у 4% обследуемых, у 5% женщин внутрима- точные синехии визуализировались в области трубных углов, и у 9% - имели вид единичных тяжей. У 24,1% отмечалась гиперемия, легкая ранимость стенок, которые кровоточили при прикосновении, имелись островки белесоватого или желтоватого цвета, гипертрофированная отечная слизистая оболочка матки. В процессе гистероскопии всем пациенткам проводили биопсию эндометрия с последующим гистологическим и иммуногистохимическим исследованиями, по результатам которых были сформированы четыре группы: 1-я группа - 33 пациентки с гиперплазией эндометрия, 2-я группа - 20 пациенток с внутрима- точными синехиями, 3-я группа - 19 пациенток с хроническим эндометритом, 4-я группа - 7 пациенток с эндометрием в фазе пролиферации. Морфологическая картина в 1-й группе соответствовала простой гиперплазии эндометрия без атипии. Отмечалось повышенное количество как железистых, так и стромальных элементов, однако отсутствовало % [§§§ Лазерная деструкция внутриматочных синехий [Щ Эко и ПЭ 0 Гистероскопия ГЛ РДВ (раздельное диагностическое выскабливание) И Лапароскопия И Искусственный аборт Оригинальные статьи Рис. 1. Частота гинекологических оперативных вмешательств у больных с первичным и вторичным бесплодием. тесное расположение желез, которые имели округлые очертания и были разнообразны по величине (рис. 2; см. на 3-й полосе обложки). Во 2-й группе морфоструктура эндометрия соответствовала диагнозу «внутриматочные синехии». Эндометрий находился в фазе пролиферации, строма его в значительной степени заменена фиброзной тканью, железы представлены неактивным призматическим эпителием эндометриального типа, а также определялись аваскулярные ткани, кальцификация стромы и желез. Морфологическая картина в 3-й группе соответствовала хроническому эндометриту. Отмечалось наличие множества воспалительных инфильтратов, состоящих преимущественно из плазматических клеток и лимфоидных элементов. Очаговые инфильтраты имели вид «лимфоидных фолликулов» и располагались не только в базальном, но и во всех отделах функционального слоя эндометрия, в состав их входили лейкоциты и гистиоциты (рис. 3; см. на 3-й полосе обложки). Склеротические изменения стенок спиральных артерий эндометрия и очаговый фиброз стромы свидетельствовали о длительном хроническом воспалении. Морфологическая картина в 4-й группе - эндометрий соответствовал фазе пролиферации, железы мелкие, расположены равномерно, строма рыхлая, сосуды многочисленные с тонкими стенками (рис. 4; см. на 3-й полосе обложки). Результаты иммуногистохимического исследования эндометрия у пациенток всех групп представлены в таблице. Original papers При сравнении экспрессии ER- и PR-рецепторов достоверных различий у пациенток 1-й, 2-й и 4-й групп не выявлено. В ходе исследования обнаружено, что показатели ER:PR в стадии пролиферации были практически равны 1 (р < 0,05). Отмечалась неравномерная экспрессия ER и PR в строме и железах, с преобладанием ее в железах. Индекс экспрессии эстрогеновых и про- гестероновых рецепторов у пациенток в группе с хроническим эндометритом был понижен и составил 77,8 и 74,2% соответственно (р > 0,05), что свидетельствует о нарушении синтеза эстрогеновых и прогестероновых рецепторов железистых и стромальных клеток. Следовательно, эндометрий при хроническом воспалении становится слабовосприимчив к эстрогенам и прогестерону. У пациенток всех групп выявлена неравномерная, низкая пролиферативная активность клеток эндометрия. Отмечено снижение уровня экспрессии Ki-67 как в эпителии желез, так и в клетках стромы (р < 0,05). Полученные данные не коррелируют с экспрессией рецепторов к эстрогенам и прогестерону, что может свидетельствовать о наличии неполноценного «окна имплантации». Выявлено снижение числа основных иммуноком- петентных клеток эндометрия (РВ56-позитивных клеток) во всех группах (р < 0,05), что проявлялось низкой цитотоксической активностью (рис. 5; см. на 3-й полосе обложки) и уменьшением количества макрофагов СБ68 в эндометрии (р < 0,05), тогда как для обеспечения нормального процесса имплантации количество этих клеток в первую фазу менструального цикла должно повышаться. Уровень экспрессии маркера плазматических клеток CD138 у пациенток 1-й группы оказался невысоким, а в эндометрии у пациенток 2-й и 4-й групп экспрессия CD138 отсутствовала (р < 0,05). Это свидетельствует о незначительных воспалительных изменениях в эндометрии у пациенток 1-й группы и отсутствии воспалительных процессов у пациенток 2-й и 4-й групп. Полученные данные маркера плазматических клеток CD138 говорят о незначительной роли воспалительных Результаты иммуногистохимического исследования эндометрия у пациенток четырех групп Маркеры 1-я группа 2-я группа 3-я группа 4-я группа CD34# 2,1 ± 0,5 2,0 ± 0,0 2,0 ± 0,0 2,5 ± 0,8 CD56* 45,2 ± 2,1 37,8 ± 2,1 43,2 ± 3,8 77,3 ± 2,09 CD68* 59,5 ± 1,4 35,3 ± 1,6 40,4 ± 1,5 41,8 ± 1,1 CD138*** 6,8 ± 2,1 - 9,7 ± 3,9 - Ki-67 (железы)** 39,3 ± 1,2 39,8 ± 2,5 25,8 ± 2,5 26,1 ± 0,4 Ki-67 (строма)*** 23,3 ± 2,7 16,3 ± 2,3 22,6 ± 0,7 13,3 ± 1,09 гп 73 ■€ 96,0 ± 2,04 92,9 ± 3,2 77,8 ± 2,4 93,5 ± 2,1 PRT 90,0 ± 3,5 87,4 ± 3,0 74,2 ± 1,3 95,6 ± 1,4 VEGF# 2,0 ± 0,0 - 2,0 ± 0,0 2,2 ± 0,7 Примечание. * - количество позитивных клеток в поле зрения при увеличении 400; ** - индекс пролиферации (отношение количества окрашенных ядер к общему количеству ядер, %); *** - количество окрашенных ядер стромальных клеток в поле зрения при увеличении 400; ф - количество окрашенных ядер в поле зрения при увеличении 400; # - количество позитивных клеток (балл). изменений эндометрия в нарушении имплантации у пациенток с гиперпластическими процессами эндометрия и внутриматочными синехиями, тогда как у пациенток с хроническим эндометритом повышенная экспрессия маркера плазматических клеток CD138 является фактором, препятствующим имплантации, и подтверждает наличие воспалительных изменений эндометрия. Экспрессия CD34 (маркер, отвечающий за ранние этапы кроветворения) во всех группах проявлялась позитивной интенсивной реакцией в эндотелии спиральных артерий, многочисленных капиллярах и клетках стромы, что свидетельствует о том, что сосуды закладываются нормально, идет нормальная пролиферация эндотелиоцитов (р < 0,05). Однако в 4-й группе выявлены более высокие показатели для данной фазы менструального цикла (пролиферации), что может говорить об интенсификации процессов пролиферации эндо- телиоцитов в базальном слое и строме эндометрия. В норме нарастание экспрессии CD34 в базальном слое и строме эндометрия отмечается во второй фазе цикла. Таким образом, у пациенток 4-й группы можно предположить низкую вероятность фиброза эндотелиоцитов, что не исключает наличие его у пациенток 1-й, 2-й и 3-й групп. Экспрессия VEGF в 1-й и 3-й группах (р < 0,05) проявлялась позитивной реакцией в отдельных клетках стромы и эндотелия сосудов, что говорит о снижении процессов неоангиогенеза, обусловливающем недостаточное кровоснабжение и гипоксию тканей вследствие уменьшения диффузии кислорода. Низкий уровень VEGF приводит к сниженному сосудообра- зованию, которое в дальнейшем еще более уменьшает сосудистый кровоток в эндометрии. Экспрессия VEGF в 4-й группе проявлялась позитивной реакцией во всех клетках стромы и в эндотелии сосудов. Однако во 2-й группе экспрессия VEGF отсутствовала, что свидетельствует о выраженных нарушениях процессов неоангиогенеза. Заключение Определение иммуногистохимического профиля эндометрия у пациенток с маточной формой бесплодия позволяет провести более точную оценку состояния слизистой оболочки полости матки. Нарушение процессов имплантации может быть связано с изменением экспрессии ER и PR, низким содержанием иммуноком- петентных клеток CD56 и макрофагов СD68 в эндометрии, а также с ослаблением процессов неоангиогене- за, что, по-видимому, обусловливает гипоксию тканей. Низкий уровень экспрессии Ki-67 указывает на недостаточную пролиферативную активность эндометрия, что также является препятствием для имплантации. Таким образом, иммуногистохимические показатели могут служить дополнительным критерием оценки рецепторной активности, полноценности пролифератив- Оригинальные статьи ной и репаративной функций эндометрия перед планированием беременности. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсу тст- вии конфликта интересов.

About the authors

Narina A. Arutyunyan

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

Email: narinaarutyunyan@yandex.ru
obstetrician-gynecologist of the Center for Restorative Medicine of the I.M. Sechenov First Moscow State Medical University Moscow, 119991, Russian Federation

T. A Dzhibladze

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

Department of Obstetrics and Gynecology No 1 of the Faculty of Medicine Moscow, 119991, Russian Federation

V. M Zuev

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

Department of Obstetrics and Gynecology No 1 of the Faculty of Medicine Moscow, 119991, Russian Federation

A. I Ishchenko

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

Department of Obstetrics and Gynecology No 1 of the Faculty of Medicine Moscow, 119991, Russian Federation

D. V Bryunin

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

Department of Obstetrics and Gynecology No 1 of the Faculty of Medicine Moscow, 119991, Russian Federation

I. D Khokhlova

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

Department of Obstetrics and Gynecology No 1 of the Faculty of Medicine Moscow, 119991, Russian Federation

References