Эффективное редактирование локуса CXCR4 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов Cas9, стабилизированных полиглутаминовой кислотой

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Редактирование генов с помощью системы CRISPR/Cas9 открывает новые возможности в лечении заболеваний человека. По этой причине актуальной является разработка подходов для повышения эффективности геномного редактирования. В данной работе для повышения уровня редактирования локуса CXCR4, мишени для генотерапии ВИЧ-инфекции, белок Cas9 модифицировали, вводя дополнительные сигналы NLS, а рибонуклеопротеиновые комплексы Cas9 и гидовой РНК стабилизировали с помощью поли-L-глутаминовой кислоты. В совокупности это позволило в 1.8 раза повысить уровень нокаута CXCR4 в Т-клеточной линии CEM/R5 и в 2 раза повысить уровень нокина пептидного ингибитора слияния ВИЧ-1 МТ-С34 в первичных CD4+ Т-лимфоцитах.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Д. С. Голубев

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru

Институт биологии гена Российской академии наук

Россия, Москва

Д. С. Комков

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины; Ben-Gurion University of the Negev

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru

Институт биологии гена Российской академии наук, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences

Россия, Москва; Be’erSheva, Israel

М. В. Шепелев

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru

Институт биологии гена Российской академии наук

Россия, Москва

Д. В. Мазуров

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины; University of Minnesota

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru

Институт биологии гена Российской академии наук, Division of Infectious Diseases and International Medicine, Department of Medicine

Россия, Москва; Minneapolis, USA

Н. А. Круглова

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru

Институт биологии гена Российской академии наук

Россия, Москва

Список литературы

  1. Pavlovic K., Tristán-Manzano M., Maldonado-Pérez N., et al. Using Gene Editing Approaches to Fine-Tune the Immune System // Front. Immunol. Frontiers Media SA, 2020. V. 11.
  2. Shams F., Bayat H., Mohammadian O., et al. Advance trends in targeting homology-directed repair for accurate gene editing: An inclusive review of small molecules and modified CRISPR-Cas9 systems // BioImpacts. 2022. V. 12. № 4. P. 371–391.
  3. Smirnikhina S. A., Zaynitdinova M. I., Sergeeva V. A., et al. Improving Homology-Directed Repair in Genome Editing Experiments by Influencing the Cell Cycle // Int. J. Mol. Sci. 2022. V. 23. № 11. P. 5992.
  4. Cornu T. I., Mussolino C., Müller M. C., et al. HIV Gene Therapy: An Update // Hum. Gene Ther. Hum Gene Ther. 2021. V. 32. № 1–2. P. 52–65.
  5. Maslennikova A., Mazurov D. Application of CRISPR/Cas Genomic Editing Tools for HIV Therapy: Toward Precise Modifications and Multilevel Protection // Front. Cell. Infect. Microbiol. Frontiers Media S. A. 2022. V. 12. P. 880030.
  6. Hou P., Chen S., Wang S., et al. Genome editing of CXCR4 by CRISPR/cas9 confers cells resistant to HIV-1 infection // Sci. Rep. 2015. V. 5. P. 15577.
  7. Wang Q., Chen S., Xiao Q., et al. Genome modification of CXCR4 by Staphylococcus aureus Cas9 renders cells resistance to HIV-1 infection. // Retrovirology. 2017. V. 14. № 1. P. 51.
  8. Maslennikova A., Kruglova N., Kalinichenko S., et al. Engineering T-Cell Resistance to HIV-1 Infection via Knock-In of Peptides from the Heptad Repeat 2 Domain of gp41 // MBio. American Society for Microbiology. 2022. V. 13. № 1.
  9. Kim S., Kim D., Cho S. W., et al. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins // Genome Res. 2014. V. 24. № 6. P. 1012–1019.
  10. Maggio I., Zittersteijn H. A., Wang Q., et al. Integrating gene delivery and gene-editing technologies by adenoviral vector transfer of optimized CRISPR-Cas9 components // Gene Ther. 2020. V. 27. № 5. P. 209–225.
  11. Nguyen D. N., Roth T. L., Li P. J., et al. Polymer-stabilized Cas9 nanoparticles and modified repair templates increase genome editing efficiency // Nat. Biotechnol. 2020. V. 38. № 1. P. 44–49.
  12. Cong L., Ran F. A., Cox D., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems // Science. 2013. V. 339. № 6121. P. 819–823.
  13. Shui S., Wang S., Liu J. Systematic Investigation of the Effects of Multiple SV40 Nuclear Localization Signal Fusion on the Genome Editing Activity of Purified SpCas9 // Bioengineering. 2022. V. 9. № 2. P. 83.
  14. Staahl B. T., Benekareddy M., Coulon-Bainier C., et al. Efficient genome editing in the mouse brain by local delivery of engineered Cas9 ribonucleoprotein complexes // Nat. Biotechnol. 2017. V. 35. № 5. P. 431–434.
  15. Buckley C. D., Amft N., Bradfield P. F., et al. Persistent Induction of the Chemokine Receptor CXCR4 by TGF-β1 on Synovial T Cells Contributes to Their Accumulation Within the Rheumatoid Synovium // J. Immunol. 2000. V. 165. № 6. P. 3423–3429.
  16. Shy B. R., Vykunta V. S., Ha A., et al. High-yield genome engineering in primary cells using a hybrid ssDNA repair template and small-molecule cocktails // Nat. Biotechnol. 2023. V. 41. № 4. P. 521–531.
  17. Kath J., Du W., Pruene A., et al. Pharmacological interventions enhance virus-free generation of TRAC-replaced CAR T cells // Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2022. V. 25. P. 311–330.
  18. Mohr M., Damas N., Gudmand-Høyer J., et al. The CRISPR-Cas12a Platform for Accurate Genome Editing, Gene Disruption, and Efficient Transgene Integration in Human Immune Cells // ACS Synth. Biol. 2023. V. 12. № 2. P. 375–389.
  19. Oh S. A., Senger K., Madireddi S., et al. High-efficiency nonviral CRISPR/Cas9-mediated gene editing of human T cells using plasmid donor DNA // J. Exp. Med. 2022. V. 219. № 5.
  20. Makkerh J. P.S., Dingwall C., Laskey R. A. Comparative mutagenesis of nuclear localization signals reveals the importance of neutral and acidic amino acids // Curr. Biol. 1996. V. 6. № 8. P. 1025–1027.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. (а) Схемы плазмидных конструкций для экспрессии Cas9 с различным числом NLS в клетках E.coli. Пока- заны аминокислотные последовательности NLS вируса SV40, NLS из белка нуклеоплазмина и последовательность второго оснóвного мотива из NLS нуклеоплазмина (PAAKKKK) [20]. (б) Электрофореграмма лизатов клеток E.coli BL21 (DE3), трансформированных одной из четырех конструкций для продукции Cas9, до и после индукции экс- прессии с помощью IPTG. Белки разделяли в 7.5 % акриламидном геле и окрашивали красителем Кумасси R‑250. М – маркеры молекулярного веса белков.

Скачать (363KB)
Метаданные
3. Рис. 2. (а) Уровень нокаута CXCR4 в клетках CEM/R5, электропорированных RNP с Cas9–1xNLS или Cas9– 3xNLS. (б) Уровень нокаута CXCR4 в клетках CEM/R5, электропорированных комплексами RNP с добавлением PGA (+) или без добавления PGA (–). Экспрессию белка CXCR4 анализировали с помощью проточной цитометрии проводили на 3 день после электропорации. (в) Уровень нокина пептида МТ-С34 в локус CXCR4 в CD4+ Т-лимфо- цитах, электропорированных RNP с Cas9-3xNLS вместе с донорной плазмидой pJet-X4ex2 в присутствии PGA (+) или без PGA (–).

Скачать (206KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024