MORPHOLOGICAL AND MOLECULAR CRITERIA OF THE ENDOMETRIAL RECIPTIVITY VIOLATION IN PATIENTS WITH INFERTILITY ASSOCIATED WITH CHRONIC ENDOMETRITIS

Full Text

Одно из актуальных направлений современного здравоохранения связано с проблемой бесплодного брака, частота выявления которого колеблется около 15,0-17,5% и не имеет тенденции к снижению [1]. Эффективность применяемых у бесплодных супружеских пар методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) не превышает 25-30% на одну попытку [2]. Успешность имплантации и дальнейшее полноценное развитие эмбриона в циклах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) определяются, с одной стороны, качеством самого эмбриона, а с другой - морфофункциональным состоянием эндометрия [3]. В настоящее время благодаря бурному развитию молекулярных методов исследования рецептивность эндометрия рассматривается как комплекс структурно-функциональных характеристик эндометрия с чёткими временными и пространственными константами, определяющий наибольшую восприимчивость слизистой оболочки полости матки к внедрению эмбриона в специфический период «окна имплантации» [4]. Хронический эндометрит (ХЭ) является одной из ведущих причин, приводящих к снижению рецептивности эндометрия [5]. К факторам, определяющим успешную имплантацию, относятся рецепторы к эстрогенам ER, к прогестерону - PR [6], ингибирующий фактор лейкемии - LIF [7], клаудины - CLDNs [8], интегрины [9], селектины [10], кадгерины [9], муцины [9], сосудистый эндотелиальный фактор роста VEGF [11], гепаринсвязывающий эпидермальный фактор роста HB-EGF [10] и ген семейства homeobox HOXA-10 [12]. Только достаточная и согласованная экспрессия всех вышеперечисленных молекул обеспечивает имплантацию бластоцисты в эндометрий. При ХЭ вероятность рассогласования действий этих механизмов крайне велика. Цель исследования - изучить морфологические и молекулярные особенности рецептивности эндометрия у женщин репродуктивного возраста с бесплодием и неудачными попытками ЭКО в анамнезе на фоне хронического эндометрита. Материал и методы В исследование включили 120 женщин репродуктивного возраста с морфологически верифицированным диагнозом ХЭ, обратившихся для планирования беременности в медицинские учреждения, являющиеся клиническими базами кафедры акушерства и гинекологии № 1 лечебного факультета Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова, в 2012-2013 гг. Пациентки с ХЭ были разделены на 2 группы в зависимости от возможности реализации генеративной функции: 1-я, основная группа (n = 64) - женщины с бесплодием и неудачными попытками ЭКО, 2-я группа (n = 58) - женщины с сохранённой фертильностью; 2-я группа была сформирована ретроспективно на основании факта наступления беременности в течение 1 года с момента окончания комплексной терапии ХЭ. Группу контроля (3-я группа) составили 30 здоровых фертильных пациенток, которым была проведена пайпель-биопсия эндометрия во II фазе менструального цикла перед постановкой спирали. Пациенток 1-й и 2-й групп на этапе планирования беременности обследовали общеклиническими, лабораторными и инструментальными методами, учитывали данные гинекологического анамнеза, а также проводили детальное морфологическое и иммуногистохимическое исследование эндометрия. Забор тканей эндометрия осуществляли посредством аспирационной биопсии с использованием канюли Pipelle de Cornier («Laboratoire C.C.D.», Франция) по стандартной методике на 7-10-й и 18-24-й дни менструального цикла. Каждая пациентка перед вступлением в исследование подписывала информированное добровольное согласие. Морфологическое и иммуногистохимическое исследования эндометрия проводились на кафедре патологической анатомии им. академика А.И. Струкова Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова. Полученные образцы эндометрия фиксировали в 10% растворе формалина в течение 24 ч с последующей заливкой материала в парафин и изготовлением срезов толщиной 4-5 мкм по стандартной методике. Срезы эндометрия фиксировали на полилизиновых стеклах («Mainzel Glaser», Polylisine, Германия), окрашивали гематоксилином и эозином и изучали посредством световой микроскопии при 100-400-кратном увеличении. Для выполнения иммуногистохимического исследования изготовляли депарафинированные срезы эндометрия с последующей их обработкой стрептавидин-биотин-пероксидазным методом с демаскировкой антигена по стандартной методике. В качестве первичных специфических антител использовали моноклональные антитела к CD16, CD20, CD56, HLA-DRII («Novocastra», Великобритания), а для оценки рецептивности эндометрия - антитела к ER и PR («DAKO», Дания), LIF («R&D Systems») и CLDN4 («Lab Vision»). Оценка экспрессии LIF и CLDN4 в эндометрии проводилась полуколичественным методом по 6-балльной системе: 0 баллов - отсутствие иммуноокрашенных клеток, 0,5 балла - при выявлении до 5% иммуноокрашенных клеток, 2 балла - при определении 5-20% иммуноокрашенных клеток, 4 балла - 20-40% иммуноокрашенных клеток, 6 баллов - при регистрации более 40% иммуноокрашенных клеток [13]. Оценку экспрессии ER и PR проводили методом гистологического счёта HistoScore, учитывая количество и интенсивность окрашенных клеток эпителия желёз и стромы эндометрия, и вычисляли по формуле: HS = 1a + 2b + 3c, где HS - HistoScore, a, b, c - число слабо, умеренно и сильно окрашенных клеток соответственно (в %); 1, 2, 3 - степень экспрессии ER и PR, выраженная в баллах. Степень выраженности экспрессии ER и PR оценивали: 0-10 баллов - при отсутствии экспрессии ER и PR; 11-100 баллов - слабая экспрессия ER и PR; 101-200 баллов - умеренная экспрессия ER и PR; 201-300 баллов - выраженная экспрессия ER и PR [3]. Обработка полученных в ходе исследования данных выполнена с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows v. 7.0 компании «StatSoft® Inc.» (США, 2006) с применением параметрических и непараметрических методов. Для выявления прогностически значимых показателей применяли ROC-анализ, при котором по вычисленному значению площади под кривой AUC оценивали качество проверяемой модели: отличное - при AUC = 0,9-1,0; очень хорошее - при AUC = 0,8-0,9; хорошее - при AUC = 0,7-0,8; среднее - при AUC = 0,6-0,7 и неудовлетворительное - при AUC < 0,6. Для проверки полученных моделей рассчитывали их чувствительность, специфичность и точность. Результаты и обсуждение Пациентки обследованных групп были сопоставимы по соматическому статусу и среднему возрасту (1-я группа - 31,90 ± 0,71 года, 2-я группа - 30,20 ± 0,88 года, 3-я группа - 32,20 ± 0,98 года; р > 0,05). Средняя продолжительность ХЭ с момента его морфологической верификации достоверно преобладала у пациенток основной группы и составила 5,50 ± 0,06 года, тогда как в группе сравнения ХЭ протекал в среднем 2,40 ± 0,07 года (р < 0,001). Полученные данные подчёркивают важное прогностическое значение длительности течения ХЭ в отношении объёма повреждения эндометрия, приводящего к критическому снижению его рецептивности и развитию бесплодия. Проведённый нами анализ репродуктивной функции у пациенток с ХЭ выявил не только достоверное преобладание среднего числа беременностей на одну женщину 2-й группы по сравнению с 1-й группой - 5,90 ± 0,26 и 4,50 ± 0,15 соответственно (р < 0,001), но и показал достоверные различия в структуре исходов наступивших в анамнезе беременностей у пациенток обследованных групп. Так, в 1-й группе родами завершились 87 (29,9%) беременностей, самопроизвольно прервались 84 (28,9%), а искусственным абортом закончились 111 (38,1%) из них, тогда как вo 2-й группе данные показатели составили 263 (79,5%), 23 (6,9%) и 39 (11,8%) беременностей соответственно (р < 0,001). Развитие острого эндометрита после искусственного аборта, самопроизвольного выкидыша и в послеродовом периоде достоверно чаще отмечали в 1-й группе - в 103 (92,8%), 52 (61,9%) и 29 (33,3%) случаях, тогда как во 2-й группе воспалительные осложнения выявлялись в среднем в 2,5 раза реже - в 15 (38,5%), 10 (37%) и 27 (10,3%) случаях соответственно (р < 0,01). Полученные нами данные свидетельствуют о преимущественно вторичном характере бесплодия, ассоциированного с ХЭ, и указывают на значимую роль постабортных и послеродовых инфекционно-воспалительных осложнений в генезе этого заболевания. Неудачные попытки ЭКО были зарегистрированы у всех пациенток 1-й группы, причём среднее количество неудач на одну женщину составило 1,60 ± 0,09 цикла. По результатам морфологического исследования эндометрия, проведённого на 7-10-й день менструального цикла, ХЭ верифицирован у женщин 1-й и 2-й групп. Гистологическая картина в обеих группах соответствовала классическому симптомокомплексу ХЭ, критерием которого было выявление в базальном и функциональном слоях эндометрия воспалительных клеточных инфильтратов, располагавшихся преимущественно вокруг желёз и спиральных артерий. Клеточный состав этих инфильтратов был представлен клетками мононуклеарного ряда - лимфоцитами, макрофагами и плазмоцитами, тогда как по периферии инфильтратов располагались фибробласты. У пациенток 1-й группы обнаруживалась преимущественно диффузная лимфоплазмоцитарная инфильтрация эндометрия с перигландулярным и периваскулярным скоплением лимфоидных фолликулов, окружённых фибробластами (рис. 1, а, см. 2-ю полосу обложки), а также очаговый склероз стромы и утолщение стенок спиральных артерий с развитием периваскулярного фиброза (рис. 1, б, см. 2-ю полосу обложки), тогда как во 2-й группе - только очаговая инфильтрация эндометрия. Гистологическое строение эндометрия у женщин 1-й группы существенно отставало от дня цикла и соответствовало в 32 (50,0%) случаях ранней секреторной и в 19 (29,7%) случаях - поздней пролиферативной фазе цикла, тогда как в 31 (55,4%) случае в группе сравнения и во всех образцах группы контроля выявляли среднесекреторный эндометрий (табл. 1). Проведённый нами анализ количества зрелых пиноподий в апикальной части поверхностных эпителиоцитов эндометрия у обследованных пациенток выявил достоверно резкое его снижение в 1-й группе, умеренное снижение во 2-й группе и соответствие физиологической норме в группе контроля, о чем свидетельствовало обнаружение зрелых пиноподий в 8 (12,5%), 16 (28,6%) и 13 (43,3%) случаях соответственно (р < 0,05) (рис. 2, см. 2-ю полосу обложки). Полученные результаты, свидетельствующие о нарушении созревания пиноподий, могут быть отчасти связаны с глобальным запаздыванием созревания эндометрия. Таким образом, секреторные изменения эндометрия у пациенток основной группы, включая количество зрелых пиноподий в апикальной части поверхностных эпителиоцитов, отставали от дня менструального цикла, тогда как в группах сравнения и контроля строение эндометрия чётко соответствовало фазе цикла. На основании корреляционного анализа Пирсона установлена умеренная корреляционная зависимость между длительностью течения ХЭ и морфологическими критериями нарушения рецептивности эндометрия у пациенток с бесплодием, ассоциированным с ХЭ: прямая зависимость - с неполноценной секреторной трансформацией эндометрия (r = 0,470 при р < 0,001), степенью выраженности лимфоплазмоцитарной инфильтрации (r = 0,522 при р < 0,001) и фиброзом стромы эндометрия (r = 0,369 при р < 0,05), обратная зависимость - с количеством зрелых пиноподий в апикальной части поверхностных эпителиоцитов эндометрия (r = -0,5682 при р < 0,0001). С целью диагностики ХЭ в фазу секреции и уточнения возможности наличия аутоиммунного компонента заболевания произведена иммуногистохимическая оценка экспрессии в эндометрии маркеров воспаления CD16, CD20, CD56 и HLA-DRII на 18-24-й день цикла. Описанные маркеры являются поверхностными антигенами, экспрессирующимися на поверхности большинства лимфоцитов, в частности натуральных клеток-киллеров (CD16 и CD56) и В-лимфоцитов (CD20), а также антигенпредставляющих клеток, таких как дендритные клетки, макрофаги и В-лимфоциты (HLA-DRII). Снижение экспрессии CD16 и CD56 на поверхности NK-клеток наблюдается при аутоиммунных заболеваниях, тогда как повышение экспрессии маркеров характерно для длительно текущих хронических воспалительных, в том числе вирусных, заболеваний. HLA-DRII (антиген главного комплекса гистосовместимости II класса) является функциональным маркером и находится в пределах нормы при благоприятном течении заболевания, тогда как при активации хронического воспалительного процесса и на фоне аутоиммунной патологии его экспрессия резко повышается. Результаты проведённых иммуногистохимических реакций эндометрия во II фазу цикла у обследуемых групп пациенток представлены в табл. 2. У 58 (90,6%) пациенток основной группы и 2 (3,6%) женщин группы сравнения выявлено сочетание высокого уровня экспрессии CD16, CD20 и CD56 с незначительным количеством HLA-DRII-позитивных клеток, что свидетельствовало о наличии у них активного ХЭ с аутоиммунным компонентом (р < 0,001; ОР 25,38; 95% ДИ 6,49-99,19) (см. табл. 2; рис. 3, см. 2-ю полосу обложки). С другой стороны, у 54 (96,4%) женщин группы сравнения и 6 (9,4%) пациенток основной группы зарегистрирована высокая экспрессия в эндометрии CD16 и CD20 на фоне малого количества CD56- и HLA-DRII-позитивных клеток, что подтверждало верифицированный ранее ХЭ без аутоиммунного компонента в стадии ремиссии (р < 0,001; ОР 0,10; 95% ДИ 0,05-0,21). В группе контроля в подавляющем большинстве образцов эндометрия маркеры воспаления не определялись, а в остальных случаях отмечалась крайне низкая их экспрессия, что подтверждало отсутствие в них признаков ХЭ (рис. 4, см. 3-ю полосу обложки). С целью оценки полноценности секреторной трансформации эндометрия изучали экспрессию в нём стероидных рецепторов ER и PR, определявшуюся при иммуногистохимическом исследовании в виде коричневого окрашивания ядер клеток желёз и стромы эндометрия (табл. 3). Проведённый анализ установил статистически достоверно значимую низкую экспрессию ER как в железах (95,0 ± 8,6 балла), так и в строме эндометрия (41,3 ± 9,3 балла) у пациенток основной группы, тогда как в группах сравнения и контроля выявлена их умеренная экспрессия в железах (123,5 ± 11,7 и 121,1 ± 10,6 балла) и в строме (68,5 ± 10,6 и 85,6 ± 11,3 балла) эндометрия (р < 0,01) (рис. 5, а, см. 3-ю полосу обложки). Экспрессия PR во всех изученных структурах у всех обследованных нами пациенток была умеренной и высокой (159,0 ± 17,6-182,2 ± 21,0 балла) с достоверным её снижением у пациенток 1-й (р < 0,001) и 2-й (р < 0,05) групп относительно группы контроля (рис. 5, б, см. 3-ю полосу обложки). Для оценки вероятности наступления беременности как в естественных циклах, так и в циклах ЭКО у пациенток всех исследуемых групп вычислили стромальный индекс экспрессии PR/ERα, нормальные значения которого колеблются в пределах 2-4 ед. [14]. Получено достоверное 1,5-кратное увеличение значения соотношения PR/ERα у пациенток основной группы (3,87 ± 0,93 ед.) относительно его нормальных значений в группах сравнения и контроля, составивших 2,45 ± 0,87 и 2,13 ± 0,65 ед. соответственно (р < 0,05). Полученные данные свидетельствуют о прогностически низкой эффективности предстоящих циклов ЭКО у пациенток основной группы. В доступной для анализа современной литературе информации относительно величины стромального индекса при ХЭ нам не встречалось. Таким образом, полученные нами данные о низкой экспрессии ER и PR в железах и строме эндометрия у пациенток основной группы объясняют нарушение процесса имплантации и снижение результативности проводимых у них циклов ЭКО, тогда как уровень экспрессии стероидных рецепторов в эндометрии у пациенток групп сравнения и контроля не оказывает значимого влияния на вероятность наступления беременности у данной категории женщин. Для оценки рецептивности эндометрия производили определение основного её маркера - LIF (leukemia inhibitory factor), экспрессия которого выявлялась в виде коричневого окрашивания цитоплазмы клеток железистого эпителия и стромы, а также на поверхности пиноподий эпителиоцитов эндометрия (табл. 4). Проведённый нами анализ экспрессии LIF в эндометрии продемонстрировал достоверное её снижение у пациенток основной группы вплоть до низкой (1,30 ± 0,15 балла) - в железистом эпителии и крайне низкой (0,95 ± 0,10 балла) - на поверхности пиноподий (р < 0,001) (рис. 6, см. 3-ю полосу обложки). Экспрессия LIF в группе сравнения была умеренной в железах (4,0 ± 0,3 балла) и строме эндометрия (3,8 ± 0,2 балла) и высокой - на поверхности пиноподий (4,8 ± 0,3 балла), тогда как в группе контроля отмечалось высокое накопление маркера в железистом (4,7 ± 0,2 балла) и поверхностном эпителии (5,6 ± 0,1 балла). С целью оценки имплантационной способности эндометрия в нашем исследовании была изучена экспрессия клаудина-4 - CLDN4, определявшаяся в виде коричневого окрашивания апикальной части мембран поверхностных эпителиоцитов эндометрия и в основании пиноподий (табл. 5). Анализ экспрессии CLDN4 в эндометрии установил статистически значимое её снижение в апикальной части поверхностных эпителиоцитов и в основании пиноподий в ряду группа контроля - группа сравнения - основная группа, где определялась высокая (5,1 ± 0,3 и 6,0 ± 0,01 балла), умеренная (4,1 ± 0,3 и 4,5 ± 0,2 балла) и низкая (1,5 ± 0,2 и 1,0 ± 0,1 балла) экспрессия маркера соответственно (р < 0,001) (рис. 7, см. 3-ю полосу обложки). Полученные нами результаты свидетельствуют об инициирующей роли высокой экспрессии LIF и CLDN4 в поверхностных структурах эндометрия в процессе имплантации эмбриона и объясняют критическое нарушение рецептивности эндометрия на фоне длительно текущего ХЭ. Отмеченные нами особенности экспрессии LIF в эндометрии полностью согласуются с данными литературы [5, 7], тогда как сведения о роли CLDN4 в процессе имплантации немногочисленны и отражают взаимосвязь высокой эндометриальной экспрессии самого белка с идиопатическим бесплодием [8, 15]. Научных работ, изучающих участие мРНК CLDN4 в процессе нидации эмбриона, нам не встречалось. Проведённый корреляционный анализ Пирсона выявил умеренную зависимость между длительностью течения ХЭ и молекулярными критериями нарушения рецептивности эндометрия у пациенток с бесплодием, ассоциированным с ХЭ: обратную зависимость - с экспрессией ER в железах (r = -0,507 при р < 0,0001) и строме эндометрия (r = -0,622 при р < 0,0001), экспрессией PR в железах (r = -0,560 при р < 0,0001) и строме эндометрия (r = -0,572 при р < 0,0001), экспрессией LIF в железистых эпителиоцитах эндометрия (r = -0,536 при р < 0,0001) и на поверхности пиноподий (r = -0,673 при р < 0,001), экспрессией CLDN4 в клетках поверхностного эпителия эндометрия (r = -0,611 при р < 0,0001) и в основании пиноподий (r = -0,605 при р < 0,0001); прямую зависимость - со стромальным индексом PR/ERα эндометрия (r = 0,557 при р < 0,0001). По результатам ROC-анализа, проведённого относительно экспрессии CLDN4 в поверхностных эпителиоцитах эндометрия и в основании пиноподий, получены математические модели «отличного» качества - AUC = 0,947 ± 0,023 и 0,977 ± 0,016 соответственно. Точками «cut-off» определены уровни экспрессии CLDN4, равные 1,7 балла в апикальной части поверхностных эпителиоцитов и 1,1 балла - в основании пиноподий. Таким образом, снижение экспрессии CLDN4 менее 1,7 балла в поверхностных эпителиоцитах и менее 1,1 балла в основании пиноподий у пациенток с ХЭ ассоциировано с развитием бесплодия с вероятностью 91,7 и 94,2% соответственно (табл. 6, рис. 8). Заключение Таким образом, при хроническом эндометрите, ассоциированном с развитием бесплодия и неудачными попытками ЭКО, в 90,6% случаев выявляется иммунный патогенез заболевания, характеризующийся длительным (более 5 лет) течением (высокой экспрессией в эндометрии CD16, CD20, CD56 на фоне незначительного количества HLA-DRII-позитивных клеток), нарушением секреторной трансформации эндометрия с выраженным снижением количества зрелых пиноподий на апикальной поверхности покровных эпителиоцитов эндометрия, а также резкое снижение экспрессии стероидных рецепторов ER и PR и маркеров рецептивности LIF и CLDN4. Описанные при хроническом эндометрите процессы лежат в основе стойкого нарушения имплантационной способности эндометрия, приводящего к дисфункции репродуктивной системы с развитием бесплодия и многократных неудач в циклах ВРТ у страдающих им женщин.

About the authors

Tatyana A. Demura

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University; Centre for Strategic Planning and Management of Biomedical Health Risks

Email: demura-t@yandex.ru
MD, PhD, DSci., professor of the Department of Pathological Anatomy of A.I. Strukov Medical Faculty of the I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow, 119991, Russian Federation Moscow, 119991, Russian Federation; Moscow, 119121, Russian Federation

E. A Kogan

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

Moscow, 119991, Russian Federation

Yu. M Kossovich

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

Moscow, 119991, Russian Federation

A. L Unanyan

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

Moscow, 119991, Russian Federation

References

Supplementary files