The importance of assessing nucleotide polymorphisms of the  tp53  signaling pathway genes in uterine infertility factor diagnosis

Anastasiya O. Putilo; Путило Анастасия Олеговна; Tea A. Dzhibladze; Джибладзе Теа Амирановна; Nataliya V. Pozdnyakova; Позднякова Наталья Вячеславовна; Nataliya Yu. Grygortsevich; Григорцевич Наталия Юрьевна; Evgeniya A. Svidinskaya; Свидинская Евгения Александровна; Vladimir M. Zuev; Зуев Владимир Михайлович; Irina D. Khokhlova; Хохлова Ирина Дмитриевна

doi:10.17816/2313-8726-2022-9-1-41-48

Значение оценки нуклеотидных полиморфизмов генов сигнального пути тр53 в диагностике маточного фактора бесплодия

Авторы: Путило А.О.¹, Джибладзе Т.А.¹, Позднякова Н.В.², Григорцевич Н.Ю.², Свидинская Е.А.¹, Зуев В.М.¹, Хохлова И.Д.¹
Учреждения:
1. Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский университет)
2. ООО «Система-Биотех»
Выпуск: Том 9, № 1 (2022)
Страницы: 41-48
Раздел: Оригинальные исследования
Статья получена: 17.02.2022
Статья одобрена: 17.02.2022
Статья опубликована: 15.01.2022
URL: https://archivog.com/2313-8726/article/view/100979
DOI: https://doi.org/10.17816/2313-8726-2022-9-1-41-48
ID: 100979

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ
Доступ закрыт

Доступ предоставлен
Доступ закрыт

Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Введение. По данным ВОЗ, частота женского бесплодия может достигать 30% и не имеет тенденции к снижению. При этом маточный фактор занимает одно из важнейших мест в структуре бесплодия, достигая 50%. Совершенствование методов вспомогательных репродуктивных технологий позволяет успешно преодолеть многие причины бесплодия, но в отношении маточного фактора бесплодия возможности метода ограничены.

Целью данной работы стала оценка наличия нуклеотидных полиморфизмов генов сигнального пути TP53 (LIF rs41281637, c.256G>A; LIF rs929271, n.397-2854T>G; MDM2 rs2279744, c.14+309T>G; MDM4 rs1563828, c.558+572A>G; TP53 rs1042522, c.215C>G) в эндометрии у пациенток с первичным и вторичным бесплодием.

Материалы и методы. В Клинике акушерства и гинекологии им. В.Ф. Снегирёвa в 2018–2021 гг. проведено обследование и лечение 54 пациенток в возрaсте от 26 до 48 лет с первичным или вторичным бесплодием, включающее генетическое исследование образцов эндометрия. Первую группу составили 28 пациенток с первичным бесплодием в возрасте от 26 до 42 лет. Во 2-ю группу вошли 26 пациенток в возрасте от 29 до 48 лет со вторичным бесплодием.

Результаты и обсуждение. В работе оценена экспрессия нуклеотидных полиморфизмов генов сигнального пути TP53 у пациенток с первичным и вторичным бесплодием. В результате исследования получены данные, свидетельствующие о различных вариантах нуклеотидных полиморфизмов LIF, MDM2, MDM4, TP53 при первичном и вторичном бесплодии, а также об идентичности такого маркера, как LIF rs41281637 (G/A) у пациенток обеих групп.

Заключение. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о важном вкладе генетических полиморфизмов в генах сигнального пути TP53, LIF и MDM4 в развитие первичного, а MDM2 — вторичного бесплодия у женщин.

Ключевые слова

бесплодие, рецептивность эндометрия, полиморфизм генов

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

По данным ВОЗ, частота женского бесплодия может достигать 30% и не имеет тенденции к снижению. При этом маточный фактор занимает одно из важнейших мест в структуре бесплодия, достигая 50%. В последнее время растёт влияние ожирения на реализацию репродуктивной функции [1, 2]. Избыток свободных жирных кислот может оказывать токсическое действие на репродуктивные ткани, приводя к повреждению клеток и хроническому слабовыраженному воспалительному процессу. Известно, что различные маркеры, включая С-реактивный белок, интерлейкин-6 (ИЛ-6), фактор некроза опухоли альфа (ФНО-α), ингибитор активатора плазминогена 1 (ИАПГ-1), обнаруженные у пациенток с ожирением, оказывают пагубное влияние на репродуктивный цикл [3].

Комбинация различных факторов бесплодия, неоднозначная интерпретация результатов обследования приводят к трудностям в диагностике ведущих причин бесплодия. Иногда даже после полного клинико-лабораторного обследования причина бесплодия остаётся невыявленной, и пара считается здоровой. При диагностировании бесплодия неясного генеза дальнейшее ведение бесплодной пары представляет значительные трудности, так как нет единого алгоритма действия в данной ситуации. Паре может быть предложена выжидательная тактика или вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ). В то же время дополнительные методы оценки состояния эндометрия могли бы существенно облегчить задачу в прогнозировании репродуктивных успехов у конкретной пациентки.

Совершенствование методов ВРТ позволяет успешно преодолеть многие причины бесплодия, но в отношении маточного фактора бесплодия возможности метода ограничены [4–7].

Одним из ключевых моментов для успешного наступления беременности является имплантация эмбриона, которая во многом зависит как от качества самого эмбриона, так и от морфофункционального состояния эндометрия. Морфологические изменения эндометрия и экспрессия определённых иммуногистохимических маркеров, содержание в плазме крови прогестерона, состояние пиноподий в определённый момент времени формируют полноценное «окно имплантации» и рассматриваются как маркеры рецептивности эндометрия [8].

В настоящее время установлена ключевая роль фактора, ингибирующего лейкемию (LIF), в подготовке эндометрия к имплантации и последующему развитию эмбриона [9, 10]. LIF принадлежит к семейству провоспалительных цитокинов интерлейкина-6 и на поверхности клеток связывается со своим индивидуальным рецептором (LIF-R), формируя комплекс гликопротеина 130 (gp130). В отличие от других цитокинов семейства, наибольшее количество LIF секретируется именно в тот период, когда бластоциста прикрепляется к эндометрию, то есть в так называемое окно имплантации, обеспечивая экспрессию молекул адгезии, необходимых для последующей фиксации бластоцисты. При недостаточной продукции LIF эндометрием имплантация бластоцисты не происходит. В эндометрии здоровых женщин гены сигнального пути TP53 экспрессируются в течение всего менструального цикла, а пик экспрессии приходится на «окно имплантации». Эндометрий бесплодных женщин экспрессирует значительно меньше LIF в течение периода имплантации [11].

Цель работы ― оценка наличия нуклеотидных полиморфизмов генов сигнального пути TP53: LIF rs41281637 (c.256G>A), LIF rs929271 (n.397–2854T>G), MDM2 rs2279744 (c.14+309T>G); MDM4 rs1563828 (c.558+572A>G), TP53 rs1042522 (c.215C>G) в эндометрии у пациенток с первичным и вторичным бесплодием.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В Клинике акушерства и гинекологии им. В.Ф. Сне- гирёвa в 2018–2021 гг. проведено обследование и лечение 54 пaциенток в возрaсте от 26 до 48 лет (средний возрaст 35,0±4,2 года) c жалобами на отсутствие беременности при регулярной половой жизни без контрацепции, у которых на момент обращения выявлены признаки внутриматочной патологии. Все пациентки были госпитализированы в отделение гинекологии для хирургического лечения.

Первую группу составили 28 пациенток с первичным бесплодием в возрасте от 26 до 42 лет, средний возраст 32,8 года. Во 2-ю группу вошли 26 пациенток в возрасте от 29 до 48 лет со вторичным бесплодием, средний возраст 37,1±4,4 года.

При анализе данных анамнеза пациенток 1-й и 2-й группы установили, что возраст и антропометрические данные пациенток в исследуемых группах подчинялись закону нормального распределения (p >0,05) на основании критерия Колмогорова–Смирнова, но учитывая небольшой объём выборки для каждой из групп, мы применяли здесь и далее непараметрические методы расчёта.

Тест Манна–Уитни не выявил статистически значимых различий по возрасту, не выявлено также статистически значимых различий между группами при оценке менструальной функции (возраст менархе, длительность менструального цикла, продолжительность менструации). Основным показателем, который продемонстрировал статистически значимое отличие, стал ИМТ выше 25 кг/м² ― во 2-й группе число пациенток с таким ИМТ было выше (табл. 1).

Таблица 1. Клинико-анамнестическая характеристика пациенток

Table 1. Clinical and anamnestic characteristics of patients

Анализируемый показатель	1-я группа, первичное бесплодие (n=28)	2-я группа, вторичное бесплодие (n=26)
Возраст менархе, годы	13,3±1,6	12,7±1,4
Менструальный цикл, дни	26–35	27–35
Длительность менструации, дни	4–6	3–6
Индекс массы тела до ٢٥ кг/м²	22	15
Индекс массы тела >25 кг/м²	6	11
Полип эндометрия	16	10
Гиперплазия эндометрия	6	8
Миома матки	6	5
Эндометриоз	4	3
Хронический сальпингоофорит	5	0
Внутриматочные синехии, хронический эндометрит	2	11
Попытки ЭКО* в анамнезе	6	8

*Экстракорпоральное оплодотворение.

Пациентки 1-й группы (с первичным бесплодием) чаще всего поступали в клинику с диагнозом «полип эндометрия», пациентки 2-й группы ― с диагнозом «гиперплазия и полип эндометрия», «внутриматочные синехии» и «хронический эндометрит».

Перед хирургическим лечением всем пациенткам в рамках подготовки к лечению проводили клинико-лабораторное обследование в соответствии с Приказом МЗ от 20.10.2020 г. № 1130н «Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи по профилю «акушерство и гинекология». Специальные методы исследования включали ультразвуковое исследование (УЗИ) органов малого таза с допплерометрией, офисную гистероскопию, гистеросальпингографию по показаниям. УЗИ органов малого таза выполняли на 5–7-й день цикла, оценивали размеры матки, толщину и структуру эндометрия, размеры и структуру яичников, строение миометрия. Пристальное внимание уделяли оценке срединного маточного эха (М-эхо) ― отражению от эндометрия и стенок полости матки. Исследование выполняли на ультразвуковом аппарате с конвексными трансабдоминальным и трансвагинальным датчиками с частотой 4,5–8 МГц.

В зависимости от выявленной патологии пациенткам проводили хирургическое лечение в объёме: гистероскопия, раздельное диагностическое выскабливание; гистероскопия, лазерная полипэктомия; гистероскопия, деструкция внутриматочных синехий, после чего выполняли биопсию эндометрия для гистологического исследования и выделения геномной ДНК.

Гистологическое исследование тканей. Образцы эндометрия, полученные во время операции, исследовали в лаборатории патоморфологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. Ткань эндоцервикса фиксировали в спирте-формалине и буферном 10% нейтральном формалине. Взятый материал подвергали обработке с помощью гистологической проводки тканей фирмы Pool Scientific Instruments (Швейцария) и заливали в парафин. Суммарное время фиксации материала, его проводки и заливки в парафин не превышало 1 суток. Для морфологического исследования с каждого блока выполняли не менее 10 ступенчатых срезов. Депарафинизированные срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван Гизону. Оценку гиперпластически изменённого эндоцервикса осуществляли в соответствии с классификацией экспертов ВОЗ.

Выделение геномной ДНК. В качестве биологического материала для выделения геномной ДНК использовали образцы ткани эндометрия.

ДНК выделяли с использованием набора для выделения ДНК из широкого спектра биологических образцов, спин-колонки, diaGene (Диаэм, РФ). Чистоту выделенной ДНК проверяли на спектрофотометре NanoDrop OneC, соотношение А260/280 составляло от 1,8 до 1,91, соотношение А260/230 составляло от 1,62 до 2,28. Концентрацию ДНК измеряли с помощью набора dsDNA BR на флуориметре Qubit Flex. Концентрация составила от 15 до 300 нг/мкл. Концентрация всех образцов ДНК была доведена до 2 нг/мкл.

Генотипирование ДНК в области исследуемых полиморфных маркеров проводили методом секвенирования по Сэнгеру. Дизайн праймеров осуществляли с помощью Primer-Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/).

Секвенирование. Для реакции секвенирования использовали набор BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, секвенирование проводили на генетическом анализаторе 3500 (Thermo FS).

Статистический анализ. Для расчёта статистической значимости разницы в частотах встречаемости использовали точный двусторонний тест Фишера и критерий хи-квадрат. Статистические расчёты проводились по доминантной модели (идентификация аллеля риска) и рецессивной модели (идентификация генотипа риска). Далее для групп, где обнаружены значимые различия, рассчитаны отношения шансов (ОШ), 95% доверительный интервал и критерий статистической значимости p. Для удобства расчёта разницы между группами определяли две группы с учётом каждого полиморфизма: 1) пациентки с первичным бесплодием; 2) пациентки со вторичным бесплодием. Статистический анализ производился с применением программы SNPStats software.

Исследование одобрено Локальным этическим комитетом Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (протокол от 17.01.2018 г. № 01-18). Все пациентки подписали информированное согласие на участие в исследовании и публикацию их медицинских данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Клинико-анамнестическая оценка позволила выявить отсутствие статистически значимых различий между группами в менструальной и репродуктивной функции (возраст менархе, длительность менструаций и всего менструального цикла). Среди пациенток 2-й группы чаще встречались женщины с избыточной массой тела и ожирением (11 человек) по сравнению с 1-й группой (6 человек). Пациентки с первичным бесплодием чаще всего поступали в клинику с диагнозом «полип эндометрия», пациентки со вторичным бесплодием поступали в клинику с диагнозом «гиперплазия и/или полип эндометрия», «внутриматочные синехии» и «хронический эндометрит» (табл. 2).

Таблица 2. Результаты гистологического исследования тканей эндометрия

Table 2. Results of histological examination of endometrial tissues

Гистологическое заключение	1-я группа, первичное бесплодие (n=28)	2-я группа, вторичное бесплодие (n=26)
Железисто-фиброзный полип	11	10
Железистый полип	9	5
Гиперплазия эндометрия без атипии	3	2
Эндометрий фазы пролиферации	3	7
Гистологические признаки хронического эндометрита, фиброзная ткань (синехии)	2	2

После проведённого вмешательства пациентки находились в стационаре 1–2 койко-дня, затем их выписывали в удовлетворительном состоянии для продолжения назначенной терапии в амбулаторных условиях.

Всем пациенткам в послеоперационном периоде назначали комплексную противовоспалительную, ангиопротекторную, антигипоксическую терапию, при наличии определённых показаний ― антибактериальную и гормональную терапию.

На основании результатов гистологического исследования диагноз «полип эндометрия» подтвердился у всех пациенток. Кроме того, у 3-х пациенток с первичным бесплодием и у 7 пациенток со вторичным бесплодием патологии эндометрия не обнаружено, он соответствовал фазе менструального цикла. Это косвенно может свидетельствовать о нарушении функции эндометрия при нормальном гистологическом строении.

Под рецептивностью эндометрия в литературе понимают способность эндометрия принять внедряющуюся бластоцисту. Известно, что перенос эмбриона без генетических аномалий после проведения преимплантационного генетического скрининга во многих случаях не заканчивается наступлением беременности, что может свидетельствовать о маточном факторе бесплодия в связи с нарушением рецептивности эндометрия [12].

По данным последних исследований, определённую роль в готовности эндометрия к имплантации бластоцисты могут играть генетические маркеры, в частности гены сигнального пути ТР53 [13].

Нами проанализированы результаты генетического исследования образцов эндометрия пациенток обеих групп (табл. 3).

Таблица 3. Результаты генетического анализа образцов эндометрия

Table 3. Results of genetic analysis of endometrial samples

Нуклеотидные полиморфизмы генов	1-я группа, первичное бесплодие (n=28)	2-я группа, вторичное бесплодие (n=26)
LIF rs41281637 (G/A)
G/G	28	26
LIF rs9292271 (T/G)
T/T	10	15
T/G	5	9
G/G	11	2
MDM2 rs2279744 (T/G)
T/T	7	14
T/G	16	11
G/G	3	1
MDM4 rs1563828 (A/G)
A/A	6	14
A/G	9	9
G/G	11	3
TP53 rs1042522 (G/C)
G/G	14	8
G/C	9	13
C/C	3	5

Исследование генетических полиморфных вариантов показало статистически достоверную связь с первичным бесплодием двух генетических вариантов ― rs929271 в гене LIF ― гомозиготного генотипа по минорному аллелю G/G (OR=7,76; p=0,0047) и гомозиготного генотипа по минорному аллелю G/G rs1563828 в гене MDM4 (OR=5,75; p=0,0083).

Ген фактора ингибирования лейкемии человека LIF, играющий ключевую роль в имплантации, является геном-мишенью для белка p53. Белок p53 регулирует как базальную, так и индуцируемую транскрипцию LIF посредством прямого связывания конкретных последовательностей ДНК и активации транскрипции. Выявлена ассоциация варианта G полиморфизма rs929271 в 3’ UTR гена LIF с нарушением имплантации бластоцисты. Встречаемость аллеля G много выше у женщин с идиопатическим бесплодием в возрасте до 35 лет, но не старше [14]. Эти данные получили подтверждение в нашем исследовании, а именно ― у всех 54 женщин с бесплодием в образцах эндометрия выявлен минорный аллель G/G LIF rs41281637 (G/A).

Ген MDM4 кодирует ядерный белок, содержащий на своём N-конце домен, связывающий р53, и RING finger домен на С-конце. Белок MDM4 демонстрирует структурное сходство с р53-связывающим белком MDM2. Оба белка связывают р53 (белок-супрессор опухолей) и ингибируют его активность. Показано, что оба гена (MDM4 и MDM2) избыточно экспрессируются в различных злокачественных опухолях человека. Однако в отличие от MDM2, который разрушает р53, белок MDM4 ингибирует р53 путём связывания его домена активации транскрипции. MDM4 также взаимодействует с MDM2 через RING finger домен и тормозит деградацию последнего [15]. Таким образом, MDM4 может нарушить деградацию р53, вызванную MDM2, но сохранить подавление p53-индуцированной трансактивации и апоптозных функций. Транскрипционные варианты, являющиеся результатом альтернативного сплайсинга этого гена, кодируют несколько форм белка MDM4.

Присутствие аллеля A в полиморфизме rs1563828 гена MDM4 увеличивает экспрессию кодируемого этим геном белка-супрессора р53. Ингибирование р53, в свою очередь, приводит к снижению количества LIF и вероятности имплантации [16].

Полученные нами результаты свидетельствуют о связи полиморфизма гена MDM2 варианта T/G с первичным бесплодием и варианта T/T ― с вторичным, а полиморфизм гена MDM4 показывает связь варианта G/G с первичным бесплодием, а варианта A/A ― с вторичным.

При анализе полиморфизма гена ТР53 обнаружена связь аллеля G/G с первичным бесплодием, а аллеля G/C ― с вторичным.

Полученные экспериментальные данные подтверждают литературные и свидетельствуют о важном вкладе генетических полиморфизмов в генах сигнального пути ТР53, LIF и MDM4 в развитие первичного, а MDM2 ― вторичного бесплодия у женщин [17–20].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, исследование позволило оценить экспрессию нуклеотидных полиморфизмов генов сигнального пути TP53 у пациенток с первичным и вторичным бесплодием. В результате исследования получены данные, свидетельствующие о различных вариантах нуклеотидных полиморфизмов LIF rs41281637 (c.256G>A), LIF rs929271 (n.397–2854T>G), MDM2 rs2279744 (c.14+309T>G); MDM4 rs1563828 (c.558+572A>G), TP53 rs1042522 (c.215C>G) при первичном и вторичном бесплодии, при этом выявляемость LIF rs41281637 была идентичной у пациенток обеих групп.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ / ADDITIONAL INFO

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Author contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

Финансирование. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Competing interests. The authors declares that there are no obvious and potential conflicts of interest associated with the publication of this article.

Об авторах

Анастасия Олеговна Путило

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский университет)

Автор, ответственный за переписку.
Email: an_putilo@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2137-7283

аспирант