Oxidative Metabolism Genes in Ovarian Neoplasms

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Рак яичников ― одна из ведущих причин смерти женщин от онкологических заболеваний [1]. Одним из главных механизмов его патогенеза является оксидативный стресс, который участвует в возникновении, развитии и прогрессировании рака яичников и в химиорезистентности, поскольку вызывает фенотипические модификации опухолевых клеток путём перекрёстного взаимодействия между опухолевыми клетками и окружающей стромой. Оксидативный стресс приводит к адаптивному ответу раковых клеток посредством метаболического перепрограммирования в краткосрочной перспективе, в то время как генетическое перепрограммирование обеспечивает долгосрочную адаптацию, при этом активные формы кислорода (АФК) могут способствовать молекулярно-генетическим изменениям, вызывающим прогрессирование рака, а с другой стороны, длительное повышение уровня АФК оказывает цитотоксическое действие и может индуцировать активацию путей апоптоза [2].

Оксидативный стресс, воспаление и апоптоз ― взаимосвязанные звенья канцерогенеза [3]. Воспаление, особенно хроническое, характеризуется устойчивым повреждением тканей, индуцированной повреждением клеточной пролиферацией и восстановлением [4]. При раке яичников оксидативный стресс регулирует экспрессию генов воспаления и активирует активаторный белок 1 (АР-1), индуцируемый гипоксией фактор 1α (HIF-1α), фактор теплового шока 1 (HSF-1), универсальный фактор транскрипции NF-κB, транскрипционный фактор NRF2 и опухолевый супрессор p53 [2]. NF-κB способствует инициации онкогенеза и играет решающую роль в пролиферации и выживании опухолевых клеток, но может выполнять и защитную функцию при раке яичников, регулируя экспрессию генов антиоксидантов [2]. Повышенная активация NF-κB при инвазивных злокачественных поражениях яичников по сравнению с доброкачественными или пограничными новообразованиями подтверждает связь канцерогенеза с системным воспалением [5].

Повышенные уровни АФК активируют передачу сигналов NRF2, индуцируя экспрессию антиоксидантных ферментов, таких, как гемоксигеназа (HMOX), каталаза, супероксиддисмутаза (SOD) и глутатионтрансфераза. NRF2 играет важную противовоспалительную роль, однако, хотя NRF2 способствует поддержанию стабильности нормальной среды клеток яичников и генома в условиях оксидативного стресса, но в то же время защищает раковые клетки от оксидативного повреждения и от действия цитотоксических препаратов, тем самым повышая устойчивость к химиотерапии [2].

Одно из основных мест синтеза внутриклеточных АФК ― микросомальные дыхательные цепи, представляющие собой редуктазы, встроенные в мембрану эндоплазматического ретикулума и осуществляющие транспорт электронов от НАДН или НАДФН к цитохромам. НАДН-зависимая цитохром b5-редуктаза (CYB5R) принимает участие в синтезе холестерина, элонгации жирных кислот, микросомальном гидроксилировании ксенобиотиков и стероидных гормонов, является частью трансмембранной редокс-системы, которая поддерживает в восстановленном состоянии антиоксиданты аскорбат и коэнзим Q10 и защищает клетку от апоптоза [6].

Роль цитохром b5-редуктазы в канцерогенезе изучена недостаточно, но известно, что повышенная её экспрессия коррелирует с плохим прогнозом у пациенток с эстроген-рецептор-негативным раком молочной железы, а снижение экспрессии гена этого фермента значительно уменьшает метастазирование в лёгкие на модели мышей [7]. НАДФН-зависимая цитохром P450-редуктаза (POR), помимо восстановления цитохрома Р450, может переносить электрон на цитохром b5, гемоксигеназу, сквален-монооксигеназу, 7-дегидрохолестеролредуктазу. Важнейшая задача этой цепи ― катализ метаболизма лекарств, особенно противоопухолевых препаратов [8]. Имеющиеся в литературе работы в основном посвящены участию этого фермента в метаболизме противоопухолевых препаратов.

Цель исследования — изучить экспрессию ключевых генов оксидативного метаболизма, воспаления и апоптоза CYB5R, POR, NOX4, SOD1, HMOX1, NFKB1, NRF2, BCL2, BIRC3 в тканях аденокарциномы яичника параллельно с определением активности цитохром b5-редуктазы, цитохром Р450-редуктазы и некоторых показателей оксидативного метаболизма (активности нейтрофилов крови и антиоксидантных показателей плазмы крови и перитонеальной жидкости).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование включили 16 пациенток в возрасте от 47 до 57 лет. Основную группу составили 10 пациенток с подтверждённым гистологически раком яичников (умеренно- и низкодифференцированная серозная аденокарцинома). Группа сравнения была представлена 6 пациентками с доброкачественными опухолями яичника (серозно-муцинозная цистаденома). Критерии исключения: возраст старше 75 лет, наличие первично-множественных опухолей других локализаций. Все пациентки подписали добровольное информированное согласие на включение в исследование и использование полученных медицинских данных.

Хирургическое вмешательство и наблюдение пациентов проводили в ГКБ им. Д.Д. Плетнёва Департамента здравоохранения Москвы (ДЗМ), морфологическую верификацию диагноза также выполняли в патологоанатомическом отделении ГКБ им. Д.Д. Плетнёва ДЗМ. Материалом для исследования служили образцы малигнизированной ткани, перитонеальная жидкость, плазма крови и цельная кровь, полученные в день операции. Образцы крови и перитонеальной жидкости транспортировали в вакутейнере с Li-гепарином при температуре +4°С и анализировали не позднее чем через два часа после взятия материала. Образцы ткани транспортировали в физиологическом растворе (0,9% раствор NaCl), далее делили на две части — одну часть замораживали при температуре –80°С и через месяц изучали экспрессию генов. Во второй части материала определяли активность микросомальных редуктаз не позднее чем через два часа после взятия материала.

Оценка экспрессии генов методом полимеразной цепной реакции

Уровень экспрессии генов оценивали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Из ткани выделяли РНК с использованием наборов YellowSolve («Клоноген», Россия) согласно стандартной методике с последующей фенол-хлороформной экстракцией и осаждением хлороформом и изоамиловым спиртом (49:1). Концентрацию РНК определяли с помощью красителя Quant-iTRiboGreen RNA reagent («MoBiTec», Германия) на планшетном ридере («EnSpireequipment», Финляндия) λ_ex = 487 нм, λ_fl = 524 нм. Реакцию обратной транскрипции осуществляли с помощью реактивов фирмы «Силекс» (Россия) согласно стандартной методике.

ПЦР проводили с использованием соответствующих праймеров (Синтол) и интеркалирующего красителя Sybr Green на приборе StepOnePlus («AppliedByosystems», США). Использовали следующие праймеры (Синтол

Москва, Россия):

NRF2 (NFE2L2) (F: TCCAGTCAGAAACCAGTGGAT,
	R: GAATGTCTGGCGCCAAA AGCTG);
N0X4	(F: TTGGGGCTAGGATTGTGTCTA, R: GAGTGTTCGGCACATGGGTA);
BIRC3	(F: AAGCTACCTCTCAGCCTACTTT, R: CCACTGTTTTCTGTACCCGGA);
BCL2	(F: GCCTTCTTTGAGTTCGGTGG; R: ATCTCCCGGTTGACGCTCT);
NFKB1	(F: CAGATGGCCCATACCTTCAAAT, R: CGGAAACGAAATCCTCTCTGTT);
HM0X1	(F: TCCTGGCTCAGCCTCAAATG; R: CGTTAAACACCTCCCTCCCC);
SODI	F: AGGGCATCATCAATTTCGAGC; R: GCCCACCGTGI111ICTGGA);
POR	(F: GGGATGCGAGGCATGTCAG; R: CAGGGCGTTGTCGATCTCT);
CYB5R1	(F: TCAGGCCATACACTCCTGTCA; R: CACACCCCTTCAGGTAGACCTT);
CYB5R2	(F: CAAGGGGACGCTTGTTTTACC; R: AGGTGATCGGCCAGTGTTTTT);
CYB5R3	(F: TCTACCTCTCGGCTCGAATTG; R: CCTTGTCATCATCGCTGGAGAT);
TBP (эталонный ген) (F: GCCCGAAACGCCGAATAT,
	R: CCGTGGTTCGTGGCTCTCT).

 Определение активности микросомальных редуктаз

Для регистрации активности цитохром b5-редуктазы и цитохром Р450-редуктазы применили протокол, основанный на регистрации хемилюминесценции ткани в присутствии люцигенина и НАДН или НАДФН, соответственно. Регистрацию проводили на приборе Lum-1200 («ДИСофт», Россия). Использовали реагенты: раствор Кребса–Рингера (рН 7,4), люцигенин (динитрат 10,10-диметил-9,9-биакридиния, «Sigma-Aldrich», США), НАДН и НАДФН («Sigma-Aldrich», США). Образцы перед анализом трижды промывали раствором Кребса–Рингера, биопсийной иглой 20G («GTA», Италия) производили забор трёх порций массой 15,5±0,5 мг. Пробы помещали в кюветы с раствором Кребса–Рингера и люцигенина (конечная концентрация 60 мкМ), регистрировали хемилюминесценцию при 37°С в течение 5 мин, добавляли 10 мкл 10 мМ НАДН или НАДФН и регистрировали сигнал 20 мин. Рассчитывали среднюю интенсивность стимулированного свечения I_НАДН и I_НАДФН для трёх параллельных измерений.

Определение оксидативной активности нейтрофилов

Определение оксидативной активности нейтрофилов крови проводили по следующей методике. В кювету, содержащую раствор Хенкса, стабилизированный HEPES, и люминол (45 мкМ) (все реагенты «Sigma-Aldrich», США), помещали 25 мкл цельной крови, отобранной в вакутейнеры с гепарином, и регистрировали спонтанную хемилюминесценцию в течение 10 мин, затем вносили праймирующий стимул ― форбол-12-миристат-13-ацетат (50 нг/мл). После 30 мин инкубации вносили второй стимул ― N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин (10 мкМ) и регистрировали ответ в течение не менее 60 мин. Рассчитывали амплитуду ответа нейтрофилов после двухстадийной стимуляции. Референтный интервал для практически здоровых доноров (n = 110) определён ранее и составляет 3,5–9,0 усл. ед.

Определение антиоксидантной ёмкости плазмы крови и перитонеальной жидкости

Хемилюминесценцию регистрировали при температуре 37°С в системе, содержащей генератор свободных радикалов 2,2’-азо-бис(2-амидинопропан) дигидрохлорид (АБАП) и активатор свечения люминол в фосфатном буферном растворе (100 мМ, рН 7,4) (все реагенты «Sigma-Aldrich», США). Регистрировали начальное свечение до достижения плато, добавляли 10 мкл плазмы или перитонеальной жидкости, предварительно разбавленной фосфатным буферным раствором (100 мМ, рН 7,4) в 10 раз, и проводили регистрацию до достижения нового стационарного уровня. При помощи программного обеспечения PowerGraph 3.0 («ДИСофт», Россия) определяли площадь подавления свечения S, отражающую антиоксидантную ёмкость водорастворимых антиоксидантов плазмы крови. Референтный интервал определён ранее для плазмы крови (n = 98) и составляет 195–405 усл. ед. Уменьшение S соответствует состоянию оксидативного стресса.

Статистическая обработка

Для статистической обработки данных использовали программный пакет Statistica, версия 10.0 («StatSoft Inc.», США). Проверку нормальности распределения проводили по критерию Шапиро–Уилка. Сравнительный анализ двух независимых групп по количественному признаку проводили с помощью U-критерия Манна–Уитни. Статистически значимыми считали различия при значении р ≤0,05. Для оценки корреляционных связей рассчитывали коэффициент ранговой корреляции по Спирмену.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Экспрессия генов

У пациенток с умеренно- и низкодифференцированными аденокарциномами высокой злокачественности (n = 10) и у женщин с доброкачественными новообразованиями (n = 6) в ткани новообразований определяли экспрессию генов: цитохром b5-редуктазы (CYB5R1, CYB5R2/R4, CYB5R3), цитохром Р450-редуктазы (POR), прооксидантного фермента НАДФН-оксидазы 4 (NOX4), антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы 1 (SOD1) и гемоксигеназы 1 (HMOX1), транскрипционного фактора провоспалительного пути NFKB1, транскрипционного фактора противовоспалительного пути NRF2, антиапоптотического белка-онкогена BCL2, ингибитора апоптоза BIRC3 (рис. 1).

 

Рис. 1. Экспрессия ключевых генов регуляции оксидативного метаболизма в ткани новообразований яичников в двух группах пациенток (приведено среднее значение уровня РНК исследуемого гена в трёх параллельных экспериментах по отношению к уровню РНК гена внутреннего стандарта ТВР).

*Достоверные различия между группами (p <0,05, непараметрический U-тест).

Fig. 1. Expression of key genes regulating oxidative metabolism in the tissue of ovarian neoplasms in two groups of patients (the average value of the MRNA level of the studied gene in three parallel experiments in relation to the RNA level of the gene of the internal ТВР standard is given).

*Significant differences between groups (p <0.05, nonparametric U-test).

 

Значимые различия получены для экспрессии цитохром b5-редуктазы (изоформа 3) и антиапоптотического белка BCL2 (p = 0,05). Не было значимых различий в экспрессии других изоформ цитохром b5-редуктазы (1, 2, 4 и 5), также не найдено значимых различий в экспрессии цитохром Р450-редуктазы.

Активность микросомальных редуктаз

Результаты определения активности микросомальных редуктаз в тканях новообразований яичника приведены в таблице 1.

 

Таблица 1. Интенсивность НАДН- и НАДФН-зависимой хемилюминесценции в тканях новообразований яичника (данные приведены в виде среднего и среднеквадратичного отклонения)

Table 1. The intensity of NADH- and NADPH-dependent chemiluminescence in the tissues of ovarian neoplasms (data are given in the form of mean and standard deviation)

Показатель	Доброкачественные новообразования (n = 6)	Аденокарцинома яичников (n = 10)
IНАДН*, усл. ед.	0,88 (0,55)	7,70 (3,55)
IНАДФН**, усл. ед.	1,02 (0,77)	4,40 (2,56)

*I_НАДН пропорциональна активности цитохром b5-редуктазы; **I_НАДФН пропорциональна активности цитохром Р450-редуктазы.

*I_НАДН is proportional to the activity of cytochrome b5 reductase; **I_НАДФН is proportional to the activity of cytochrome P450 reductase.

 

Активность цитохром b5-редуктазы и цитохром Р450-редуктазы была значимо выше в группе пациенток с аденокарциномой по сравнению с таковыми у женщин с доброкачественными новообразованиями, при этом активность цитохром b5-редуктазы увеличилась почти на порядок, а активность цитохром Р450-редуктазы увеличилась в четыре раза. Таким образом, цитохром b5-редуктаза ― более чувствительное метаболическое звено при раке яичников.

Оксидативная активность нейтрофилов крови и антиоксидантная ёмкость плазмы крови и перитонеальной жидкости

Для каждого случая рассчитывали оксидативную активность нейтрофилов и антиоксидантную ёмкость плазмы крови и перитонеальной жидкости (табл. 2).

 

Таблица 2. Активность нейтрофилов и антиоксидантная ёмкость плазмы крови и перитонеальной жидкости (данные приведены в виде среднего и среднеквадратичного отклонения), усл. ед.

Table 2. Neutrophil activity and antioxidant capacity of blood plasma and peritoneal fluid (data are given in the form of mean and standard deviation), conl. units

Группа пациенток	Антиоксидантная ёмкость S		Активность нейтрофилов крови
	плазма крови	перитонеальная жидкость
С доброкачественными новообразованиями (n = 6)	370 (88)	333 (110)	5,1 (3,0)
С аденокарциномой (n = 10)	328 (132)	618 (250)	4,3 (2,1)

 

Активность нейтрофилов крови в среднем соответствовала референтным значениям. Для плазмы крови значения антиоксидантной ёмкости соответствовали референтному интервалу, определённому для практически здоровых доноров, и не различались по группам. Антиоксидантная ёмкость перитонеальной жидкости для группы сравнения соответствовала показателям плазмы крови, а в случае злокачественных опухолей была увеличена примерно в два раза.

Корреляционные соотношения между экспрессией генов и показателями оксидативного метаболизма

На основании результатов экспрессии генов и ранее полученных показателей оксидативного метаболизма рассчитывали корреляции: 1) между экспрессией генов CYB5R, POR и активностью соответствующих микросомальных редуктаз; 2) между экспрессией гена NFKB1 и оксидативной активностью нейтрофилов; 3) между экспрессией гена NRF2 и антиоксидантной ёмкостью крови и перитонеальной жидкости (табл. 3).

 

Таблица 3. Коэффициенты корреляции по Спирмену между уровнями экспрессии генов и показателями оксидативного метаболизма

Table 3. Spearman correlation coefficients between gene expression levels and indicators of oxidative metabolism

Параметр	Экспрессия генов
	CYB53R	POR	NFKB1	NRF2	NRF2
Показатель оксидативного метаболизма	Активность цитохром b5-редуктазы	Активность цитохром Р450-редуктазы	Активность нейтрофилов	Антиоксидантная ёмкость плазмы	Антиоксидантная ёмкость перитонеальной жидкости
Коэффициент корреляции rs*	–0,19	0,45	0,67	0,36	0,63

*В нижней строке полужирным шрифтом отмечена корреляция средней силы: 0,3 ≤ r_S < 0,7.

*The correlation of average strength is marked in bold in the bottom line: 0,3 ≤ r_S < 0,7.

 

Слабая отрицательная корреляция найдена между экспрессией генов CYB5R3 и активностью цитохром b5-редуктазы. Для POR и активности цитохром Р-450 редуктазы найдена положительная корреляционная связь средней силы. Положительная корреляция средней силы также получена для уровня экспрессии гена NFKB1 с активностью нейтрофилов крови, а также для уровня экспрессии гена NRF2 с антиоксидантной ёмкостью плазмы крови и перитонеальной жидкости, причём корреляционная связь с антиоксидантной ёмкостью перитонеальной жидкости оказалась существенно сильнее.

ОБСУЖДЕНИЕ

К основным результатам исследования относятся:

В литературе не найдено работ по исследованию экспрессии или активности микросомальных редуктаз при раке яичников. Одна из немногочисленных работ, посвящённых изучению функции цитохром b5-редуктазы при эстроген-негативном раке молочной железы, показала значительную корреляцию между высокой экспрессией CYB5R3 и низкой безрецидивной и общей выживаемостью пациентов [7]. Наши собственные исследования показали неоднозначное изменение активности цитохром b5-редуктазы и P450-редуктазы при папиллярном раке щитовидной железы — для наиболее злокачественных случаев мы наблюдали резкое повышение активности этих ферментов [9]. Что касается цитохром Р450-редуктазы, в основном ведутся исследования её роли в метаболизме противоопухолевых препаратов, поскольку этот фермент может напрямую восстанавливать вещества [10]. Сочетание воздействия на цитохром Р450-редуктазу с применением химиотерапевтических препаратов может быть новой стратегией лечения опухолей.

В наших исследованиях показано увеличение активности цитохром Р450-редуктазы в тканях аденокарциномы высокой степени злокачественности (примерно в 4 раза по сравнению с доброкачественными опухолями), при этом экспрессия гена изменилась незначительно, однако положительная корреляция этих показателей свидетельствует, скорее всего, о регуляции активности этого фермента на генном уровне. Иная ситуация с цитохром b5-редуктазой — при значимом снижении экспрессии активность этого фермента в ткани аденокарциномы увеличилась почти на порядок. Можно предположить, что цитохром b5-редуктаза активнее вовлечена в канцерогенез, и это объясняется её многозначной ролью и локализацией не только в эндоплазматическом ретикулуме, но и на внешней мембране митохондрий. Помимо восстановления цитохрома b5, цитохром b5-редуктаза поддерживает в восстановленном состоянии коэнзим Q10, регулируя таким образом внутриклеточный антиоксидантный баланс. Возможно, повышенная активность цитохром b5-редуктазы является ответом на внутриклеточный оксидативный стресс, а сниженная экспрессия гена — результатом отрицательной обратной регуляторной связи.

Антиапоптотический белок BCL2 наряду с BAX и p53 ― основной регулятор лекарственно-индуцированного апоптоза, и BCL2 часто характеризуется сверхэкспрессией в тканях аденокарциномы [11], повышен и уровень этого белка в моче. Наличие экспрессии BCL2 при раке яичников ― благоприятный прогностический признак, особенно в BAX-негативных случаях [12].

В противоположность этому мнению, Y. Mano и соавт. полагают, что экспрессия BCL2 коррелирует с плохим ответом на химиотерапию, особенно при серозных аденокарциномах и аденокарциномах эндометрия [13]. Положительная экспрессия BCL2 и p53 при раке яичников тесно коррелировала с патологической стадией, метастазированием и рецидивами, то есть с плохим прогнозом [14]. Есть свидетельства того, что BCL2 не имеет прогностической ценности в аспекте ответа на химиотерапию и выживаемость и не зависит от характера и злокачественности опухоли [15]. Таким образом, информация о роли BCL2 в патогенезе рака яичников и его клиническом значении крайне противоречива.

В нашем исследовании экспрессия гена BCL2 была снижена в тканях аденокарциномы, что согласуется с результатами исследования [16], где обсуждается целесообразность оценки экспрессии BCL2 совместно с BAX. В целом, современная точка зрения заключается в том, что белки этого семейства могут быть перспективной терапевтической целью, однако должны рассматриваться в совокупности.

Сигнальный путь NF-κB тоже играет роль в патогенезе рака яичников. Сигнальный путь p-STAT3/NF-κB/IL-6 представляет собой каскадную петлю, участвующую в ангиогенезе при раке яичников [17]. Как у многих участников оксидативного метаболизма, роль этого пути двоякая — воспаление способствует инициации онкогенеза, пролиферации и выживанию опухолевых клеток, с другой стороны, этот путь является регулятором экспрессии генов антиоксидантов [2]. В нашем исследовании показана тенденция к увеличению экспрессии гена, что согласуется с литературными данными, однако значимые различия не получены, возможно, из-за относительно небольшого размера групп.

Экспрессия гена NFKB1 положительным образом коррелировала с активностью нейтрофилов. В недавнем метаанализе убедительно доказано, что повышение нейтрофильно-лимфоцитарного соотношения ― плохой прогностический признак при раке яичников [18]. Повышение активности нейтрофилов является отражением воспаления и может, с одной стороны, оказывать благоприятный цитотоксический эффект [19]. С другой стороны, нейтрофилы ― это мощные эффекторные клетки воспаления, способствующие опухолевой прогрессии и метастазированию, а внеклеточные нейтрофильные ловушки служат активаторами пути NF-κB [20]. Оксидативный стресс, источниками которого являются нейтрофилы, тесно связан с воспалением и активностью пути NF-κB [21], что подтверждается и нашими данными. В исследовании мы использовали новый протокол оценки активности нейтрофилов, применяющий двухстадийную стимуляцию праймирующим и основным стимулом. Этот протокол позволяет оценить полный радикал-продуцирующий потенциал нейтрофила, отражающий его максимальную активность. Для изученной когорты активность нейтрофилов в среднем соответствовала референтным значениям, что подтверждает отсутствие выраженного системного воспаления, как и отсутствие значимого повышения экспрессии NF-κB.

Ключевая роль NRF2 в канцерогенезе яичников подтверждена многими исследованиями, при этом для большинства видов рака яичников наблюдается аберрантная активация NRF2, которая часто связана с потерей числа копий в NRF2-ингибирующем комплексе KEAP1-CUL3-RBX1 [22]. В целом, высокая экспрессия NRF2 благоприятный признак при раке яичников [23]. NRF2 регулирует сигнальный путь HER1 и модулирует чувствительность раковых клеток к некоторым противоопухолевым средствам, что должно быть учтено при разработке стратегии лечения. С другой стороны, NRF2 защищает клетки от окислительного стресса и стимулирует рост опухоли и её устойчивость к химиотерапевтическим препаратам, инактивируя вызванный ими оксидативный стресс.

В наших исследованиях прослеживалась тенденция к снижению экспрессии гена NRF2 в группе пациенток с аденокарциномой, хотя значимых различий выявить не удалось. Не выходили за пределы референтного интервала и значения антиокидантной ёмкости плазмы крови. Положительная корреляция экспрессии гена NRF2 и антиоксидантной системы крови и перитонеальной жидкости подтверждает их взаимосвязь в единой антиоксидантно-противовоспалительной системе. Антиоксидантная ёмкость плазмы обеспечивается прежде всего мочевой кислотой, и мочевая кислота, согласно последним данным, выполняет не просто функции перехватчика АФК, но и действует на регуляторном уровне, увеличивая экспрессию мРНК, белков NRF2 и NRF2-чувствительных генов, включая каталитическую субъединицу гамма-глутамат-цистеинлигазы, гемоксигеназы-1 и NQO1 [24]. Мочевая кислота снижает убиквитинирование NRF2 и увеличивает ядерную транслокацию белка NRF2, тем самым активируя путь KEAP1-NRF2-ARE, при этом эффекты мочевой кислоты значительно подавлялись брусатолом, ингибитором NRF2 [25]. Таким образом, физиологические концентрации мочевой кислоты являются регулятором противовоспалительного пути NRF2, в то время как существенно повышенные уровни мочевой кислоты, наоборот, значительно ингибируют аутофагию и уровень белка сигнального пути NRF2/SLC7A11/GPX4, вызывая повреждение эндотелия и атеросклероз [26].

НАДФН-оксидаза ― важнейший источник эндогенного супероксидного анион-радикала при раке яичников, при этом для эпителиального рака яичников характерен более высокий уровень экспрессии НАДФН-оксидазы по сравнению с нормальными тканями яичников. Экспрессия NOX4 повышена при злокачественных новообразованиях яичников по сравнению с доброкачественными [27]. Повышенная экспрессия NOX4 при раке яичников индуцируется HIF-1 альфа и инсулиноподобным фактором роста IGF-1 [1]. В нашем исследовании в группе аденокарциномы экспрессия гена NOX4 была незначительно снижена по сравнению с таковой в группе пациенток с доброкачественными новообразованиями, этот факт требует дальнейшего тщательного изучения, поскольку регуляция генов семейства NOX сложна и определяется конкретным типом клеток.

Экспрессия генов антиоксидантных ферментов SOD1 и HNOX1 была незначительно снижена в группе пациенток с раком яичников. Снижение экспрессии гена SOD1 согласуется с литературными данными, демонстрирующими снижение уровня супероксиддисмутазы, каталазы и низкомолекулярных антиоксидантов (витамин С, витамин Е) при раке яичников [28]. Меньше известно о нарушениях гемового метаболизма при раке яичников, прежде всего речь идет о раке, ассоциированном с эндометриозом. Эксперименты на клеточных линиях рака яичников свидетельствуют о том, что гем индуцирует экспрессию гем-оксигеназы-1 (HO-1). Низкий уровень экзогенного гема способствовал росту колоний рака яичников, а более высокие дозы гема приводили к замедлению роста колоний раковых клеток в индукции НО-1 [29]. Вместе с тем подавление цитопротекторного пути NRF2/HO-1/xCT/GPX4 является основой действия индуктора ферроптоза при раке яичников [30]. Всё это подтверждает двойственность эффектов участников оксидативного метаболизма и необходимость тщательного изучения его роли в канцерогенезе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В тканях аденокарциномы высокой степени злокачественности значительно повышена активность цитохром b5-редуктазы, что можно объяснить ответом на внутриклеточный оксидативный стресс, при этом снижена экспрессия гена CYB5R3, но не CYB5R1 и CYB5R2\4. Снижение экспрессии гена CYB5R3 может быть результатом отрицательной обратной связи. Активность цитохром Р450-редуктазы также повышена, но в меньшей мере, и положительно коррелирует с экспрессией гена POR. Таким образом, цитохром b5-редуктаза в большей степени, чем цитохром P450-редуктаза, вовлечена в канцерогенез при раке яичников. Уровни экспрессии гена NFKB1 не различались в группах, но коррелировали с активностью нейтрофилов крови, показатели которой в целом соответствовали норме. Уровни экспрессии гена NRF2 также не различались в группах и коррелировали с показателями антиоксидантной ёмкости плазмы. Корреляция с антиоксидантной ёмкостью перитонеальной жидкости была значительно более сильной, что свидетельствует о более тесных метаболических связях на локальном уровне в брюшной полости, чем на системном уровне.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО / ADDITIONAL INFO

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Author contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

Финансирование. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Competing interests. The authors declares that there are no obvious and potential conflicts of interest associated with the publication of this article.

Этическое утверждение. Исследование одобрено Комитетом по биомедицинской этике Медико-генетического научного центра им. академика Н.П. Бочкова (протокол № 5 от 03 июля 2017 года).

Ethics approval. The study was approved by the Committee on Biomedical Ethics of the Research Centre for Medical Genetics Moscow (Protocol No. 5 of July 03, 2017).

Информированное согласие на публикацию. Все пациентки, участвовавшие в исследовании, подписали необходимые документы о добровольном информированном согласии на участие в исследовании и публикацию их медицинских данных.

Consent for publication. All the patients who participated in the study signed the necessary documents on voluntary informed consent to participate in the study and the publication of their medical data.

About the authors

Elena V. Proskurnina

Research Centre for Medical Genetics

Email: proskurnina@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8243-6339

MD, Dr. Sci. (Med.), assistant professor, Chief Researcher

Russian Federation, 1, Moskvorechye str., 15522, Moscow

Mariya V. Fedorova

Central Research Institute for Epidemiology

Email: theklazontag@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7859-6698

MD, obstetrician-gynecologist

Russian Federation, Moscow

Ekaterina A. Savinova

Research Centre for Medical Genetics

Email: savinova.ekaterina96@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5286-516X

MD, research associate

Russian Federation, 1, Moskvorechye str., 15522, Moscow

Vladimir I. Voznesenskii

D.D. Pletnev City Clinical Hospital

Email: vlad525@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5135-0997

MD, Cand. Sci. (Med.), oncologist, obstetrician-gynecologist

Russian Federation, Moscow

Svetlana V. Kostyuk

Research Centre for Medical Genetics

Author for correspondence.
Email: svet-vk@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6336-9900

MD, Dr. Sci. (Med.), assistant professor, Head of the Laboratory

Russian Federation, 1, Moskvorechye str., 15522, Moscow

Elena A. Sosnova

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: sosnova-elena@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-1732-6870
SPIN-code: 6313-9959

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files