GENETIC MARKERS OF METABOLIC DISORDERS AFTER RADICAL HYSTERECTOMY AND OOPHORECTOMY

Full Text

В последние годы большой интерес исследователей вызывает метаболический синдром (МС). Проблема ожирения в сочетании с различными метаболическими нарушениями и/или заболеваниями находится в центре внимания современных медицинских исследований. По данным ВОЗ за 2003 г., около 1,7 млрд человек на планете, то есть практически каждый четвёртый житель, имеют избыточную массу тела или ожирение. За последние 10 лет частота ожирения повсеместно возросла в среднем на 75%, и во всех регионах мира прогнозируется увеличение числа тучных людей. Предполагают, что к 2025 г. ожирением будут страдать 40% мужчин и 50% женщин. Неоднородность МС как нозологии вытекает из генетических особенностей. В настоящее время многие научные публикации указывают на участие генетических факторов в развитии МС. Учёными установлено наличие 50 генов - кандидатов в гены ожирения, также определяющих предрасположенность к сахарному диабету (СД) 2-го типа, и полигенность его наследования [1]. Ген APOE (аполипопротеин E). Ген APOE человека локализован в 19-й хромосоме [2]. Аполипопротеин Е состоит из 229 аминокислот и участвует в обмене холестерина, обеспечивая связывание липопротеидов с рецепторами липопротеинов низкой плотности (ЛПНП). Предполагают, что секретируемый астроцитами апопротеин Е захватывается нейронами (при участии белка, подобного рецептору ЛПНП) и влияет на их функцию. Аполипопротеин Е впервые был обнаружен в липопротеинах очень низкой плотности (ЛПОНП) и обозначался как «белок, богатый аргинином» [3]. АпоЕ входит в состав различных классов ЛП плазмы крови человека и животных. Наиболее высокое содержание его отмечается в ЛПОНП - 13% от общего содержания белка. В классе липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) АпоЕ выявлен только в крупных фракциях с плотностью 1,098-1,137 г/мл, обозначаемых как ЛПВП1 [4]. Три аллеля гена APOE, находящегося в сегменте 19q13.2, ответственны за образование соответствующих изоформ: Е2, ЕЗ и Е4. Известны 3 аллельных варианта гена апопротеина Е, кодирующих изоформы этого апопротеина: апопротеин Е2, апопротеин Е3 и апопротеин Е4. Эти изоформы различаются по аминокислотному составу и по сродству к апопротеин-В,Е-рецептору. 75% людей имеют фенотип Е3/Е3. У людей с фенотипом Е2/Е2 высок риск тяжёлой дисбеталипопротеидемии и атеросклероза. Распространённость «атерогенного» фенотипа Е2/Е2 среди населения составляет 1:100, однако семейная дисбеталипопротеидемия выявляется только у 1-2% людей с таким фенотипом. Описаны и другие атерогенные фенотипы. Например, полное отсутствие апопротеина Е приводит к накоплению липопротеина промежуточной плотности (ЛППП) и остаточных компонентов хиломикронов и к развитию атеросклероза в молодом возрасте. На проявления семейной гиперхолестеринемии влияют многие гены, например ген апопротеина В, ген апопротеина(а), ген липопротеидлипазы и ген апопротеина Е, а также внешние факторы, такие как режим питания или курение. Риск развития заболевания зависит от множества наследственных и внешних факторов. В результате проведённого генетического исследования полиморфных маркеров Е2/E3/E4 гена ApoЕ установлено, что среди детей с ожирением характерные для МС дислипидемии (гипертриглицеридемия - ГТГ, пониженный холестерин ЛПВП и/или высокий холестерин ЛПНП) выявлены у большинства (85,7%) носителей аллеля T4 в гетерозиготном состоянии и практически у половины (45,1%) детей с E2/E2-вариантом генотипа гена ApoЕ [1]. Ген ITGB3 локализован в длинном плече 7-й хромосомы. Мутация приводит к замене аминокислоты лейцин на пролин в 59-м положении; ген GPIII А представлен в основном в двух аллельных вариантах: PLA1 и PLA2. Частота аллеля PLА2 в европейской популяции составляет примерно 14% [5]. Ген ITGB3 кодирует белок гликопротеин GPIII A, который является тромбоцитарным рецептором фибриногена. В соответствии с этим при возникновении мутаций в структуре гена ITGB3 происходит изменение в работе рецептора фибриногена и агрегация тромбоцитов. Активно изучается ассоциация гена ITGB3 с развитием ишемической болезни сердца и практически не рассматривается в ассоциации с артериальной гипертензией (АГ). Группа белков-интегринов представлена гетеродимерными мембранными клеточными рецепторами, с помощью которых передаются межклеточные сигналы. Проведён анализ изменения частоты генотипов и мутантных аллелей генов АСЕ и ITGB3 у пациентов с АГ в сочетании с МС по сравнению с популяционными данными и соответствующими показателями у пациентов с изолированной гипертензией. Подтверждено повышение частоты генотипа ID по гену АСЕ в обеих группах (предиктор артериальной гипертензии) [6]. В исследовании Г.И. Мяндиной и соавт. [5] показана связь аллеля С с развитием осложнений при сочетанном течении ИБС и АГ, а также необходимость назначения для достижения целевых значений артериального давления (АД) большего объёма терапии за счёт применения многокомпонентного лечения и увеличения доз этих препаратов, более длительного лечения. В этом же исследовании показано прогностическое значение гена ITGB3 в развитии нарушений липидов, поскольку возрастала частота аллеля С у больных с дислипидемиями. В работе Э.Ф. Муслимовой [7] отражена достоверная ассоциация аллеля С с более высоким уровнем общего холестерина - ОХС (n = 138). В исследовании L.A. Weiss и соавт. [8] при анализе связи полиморфизмов гена ITGB3 с показателями липидного обмена обнаружена их ассоциация с уровнем липопротеина(а) именно у женщин, но не у мужчин. Считается, что повышенный уровень холестерина в сочетании с низким порогом активации тромбоцитов является значимым фактором риска развития атеротромбоза. Следовательно, женщины, являющиеся носительницами аллеля C гена ITGB3, могут входить в группу риска развития сердечно-сосудистой патологии. Анализ полиморфизма гена ITGB3 в позиции T1565C у 9233 случайно выбранных человек, из которых 267 наблюдались в течение 25 лет у врача после перелома шейки бедра, показал, что лица, имеющие генотип С/С, имели в 2 раза выше риск перелома бедра по сравнению с лицами с генотипом Т/Т. При этом риск был особенно повышен у женщин в постменопаузе, у которых отношение рисков составило 2,6 после поправки на возраст наступления менопаузы и на применение заместительной гормональной терапии [9]. Таким образом, активация тромбоцитов может быть спровоцирована действием компонентов МС; одной из составляющих МС является дислипидемия, которая может активировать адгезию и агрегацию тромбоцитов, что в свою очередь может вызвать возникновение сердечно-сосудистых осложнений. С учётом понимания патогенеза МС целесообразно рассмотреть возможность течения АГ в рамках МС при наличии изменений в структуре гена ITGB3. Ген ангиотензинпревращающего фермента (ACE) Ангиотензинпревращающий фермент переводит неактивный ангиотензин I в сосудосуживающий ангиотензин II и инактивирует брадикинин до неактивных метаболитов. Полиморфизм I/D гена АПФ стал известен научному сообществу в 1990 г. Он проявляется в виде присутствия (инсерции, I) или отсутствия (делеции, D) в 16-м интроне элемента Alu размером 287 пар нуклеотидов [10], в соответствии с чем различают гомозиготный генотип по инсерции-II, гомозиготы по делеции DD и гетерозиготный генотип ID. M.A. Dijk и соавт. в своей работе показали, что уровень АПФ у носителей генотипа DD на 60% выше, чем у лиц с генотипом II [12]. При исследовании российского населения В.С. Моисеев и соавт. выявили преобладание генотипа ID у больных с АГ, генотип DD достоверно чаще встречался только у больных с гипертрофией левого желудочка (ГЛЖ). Кроме того, распространённость аллеля D в российской популяции выше, чем в европейской [13]. Наличие аллеля D гена ACE является фактором риска АГ в связи выявленным повышением в 2 раза уровня АПФ у гомозигот DD, чем у гомозигот II [14]. Похожие данные получены B. Rigat и соавт., где при выборке 80 человек без АГ с генотипами II, ID, DD изучались уровни АПФ [11]. Некоторые исследователи, в частности N. Glavnik и соавт., отрицают вклад генотипа ID в формирование АГ [15]. Носительство генотипа II считается благоприятным при развитии АГ, поскольку поражение органов-мишеней у таких людей происходит с меньшей частотой [16], а аллель D может быть предиктором ранней манифестации АГ [17]. Показано, что у гомозигот DD по гену ACE более высокий уровень АД, а также у таких больных АГ чаще имеет кризовое течение [18]. Исследования гена АСЕ среди жителей Бангладеш показали более высокие уровни систолического (САД) и диастолического артериального давления (ДАД), причём более высокие показатели были выявлены у мужчин - носителей генотипа DD, самые низкие - у носителей генотипа II [20]. У лиц с генотипом DD выявлена ассоциация между высоким индексом массы миокарда левого желудочка (ИММЛЖ) и вариабельностью ночного АД по данным суточного мониторирования АД. Бо́льший регресс ГЛЖ у больных был отмечен при назначении ангиотензинпревращающего фермента АПФ II за счёт подавления альтернативного образования ангиотензина II [21]. F. Papp и соавт. связывают развитие заболеваний почек с генотипом DD, а O. Celik и соавт. рассматривают аллель D гена ACE как предиктор развития почечной ангиопатии у больных с АГ [22, 23]. Исследование генетических маркеров у детей с дилатационной кардиомиопатией выявило менее выраженное морфофункциональное течение и более выраженный ответ на лечение при наличии генотипа II, чем у больных с генотипом DD [24]. Установлена связь между полиморфизмом гена ACE и вероятностью развития кашля при приёме ингибиторов АПФ на примере цилазаприла. Так, при наличии в генотипе полиморфного аллеля D снижается частота возникновения побочного эффекта, что связывали с исследовавшимся в этой же работе уровнем тканевого брадикинина [25]. А применение диуретиков в терапии АГ вызывало максимальное снижение АД у больных с генотипом II, у которых в сравнении с гомозиготами DD отмечен наибольший ответ на гипотензивную терапию [16]. П.А. Синицын и соавт. провели генетическое обследование детей с ожирением и сравнили результаты с данными детей c нормальным ИМТ. При генотипировании на I/D полиморфизм гена ACE, отвечающего за активность синтеза ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС), отмечено достоверное нарастание (p < 0,05) частоты генотипа I/D и параллельное снижение частоты генотипа I/I (p < 0,05) по мере увеличения степени ожирения. Кроме того, было установлено, что 57,0% обладателей неблагоприятного по развитию АГ аллеля D как в гомо-, так и в гетерозиготном состоянии имели повышенное АД [26]. J.A. Staessen связывает наличие аллеля D с дислипидемиями [18]. Таким образом, нет однозначных данных о механизмах влияния полиморфизма I/D гена ACE на течение АГ, в том числе на уровень АД. Некоторые авторы подтверждают связь полиморфного аллеля D с МС, другие же такую гипотезу опровергают. Материал и методы В исследование включили 38 пациенток с доброкачественными заболеваниями матки, представленными изолированными формами в виде гиперплазии эндометрия, миомы матки и аденомиоза, а также их сочетанием, обратившихся в Калужскую областную клиническую больницу в 2012-2014 гг. Всем пациенткам выполнены хирургические вмешательства на матке и придатках в объёме гистерэктомии с аднексэктомией или без таковой. В зависимости от объёма оперативного вмешательства пациентки были разделены на 2 группы: 1-ю (основную) группу составили 26 пациенток, перенёсших субтотальную гистерэктомию с аднексэктомией. Во 2-ю группу (контроль) вошли 12 пациенток после субтотальной гистерэктомии без аднексэктомии. Хирургическое вмешательство выполнялось путём лапаротомии или лапароскопического доступа под эндотрахеальным наркозом. У всех пациенток в исследуемых группах проводилось исследование полиморфизма следующих генов: с.388Т>C и с.526 С>T в гене ApoE, с.2306-109-2306-108insА288 в гене АСЕ, c.176T>C в гене IGBT3. Материалом для исследования полиморфизмов служили образцы ДНК, которые получены методом фенольно-хлороформной экстракции из 10 мл цельной венозной крови. Анализ однонуклеотидных полиморфизмов генов (SNP) проводили методом минисеквенирования с последующим масс-спектрометрическим фракционированием олигонуклеотидных зондов при помощи времяпролетной (MALDI-TOF) масс-спектрометрии. Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга (РХВ) с помощью точного теста Фишера (Вейр Б., 1995). Рассчитывали ожидаемую гетерозиготность полиморфизма генов. Относительное отклонение ожидаемой гетерозиготности от наблюдаемой (D) рассчитывали по формуле: D = (hobs - hexp )/hexp, где hobs и hexp - ожидаемая и наблюдаемая гетерозиготность соответственно. Для оценки отклонений расчётной гетерозиготности от ожидаемой пороговый уровень значимости p-value принимали равным 0,05. Различия ниже заданного уровня в индивидуальных частотах считали достоверными. Для всех изученных генов соответствие равновесию Харди-Вайнберга не выходило за пороговый уровень различий менее 5%. Результаты и обсуждение Генетические особенности определяли у 38 пациенток основной (n = 26) и контрольной (n = 12) групп. У всех пациенток проведены исследования полиморфизма гена ApoE по 2 вариантам (388 T>C и 526C>T), гена ACE (полиморфизм I/D) и гена ITGB3 (позиция 1565, замена Т>C). Всего проведено 152 генетических теста. По результатам проведённых исследований определили генотипы пациенток основной и контрольной групп (табл. 1). Артериальная гипертензия В соответствии с поставленной задачей выборка пациенток была разделена на 2 группы: с проявлениями заболеваний и без таковых. В обеих группах проанализированы частоты встречаемости генотипов (табл. 2). В группе пациенток с артериальной гипертензией (n = 20) чаще обнаруживали гетерозиготу ТТ по гену ApoE, c.388T>C, гетерозиготный вариант СТ гена ApoE, c.526C>T (в 3 раза чаще, чем в контрольной группе, 30 и 11,1% соответственно). Гетерозиготы по инсерционно-делеционной замене гена ACE встречались в группе пациенток с артериальной гипертензией чаще, чем гомозиготы по обоим вариантам, в то время как в группе контроля (n = 18) генетические варианты II и ID встречались с одинаковой частотой (38,9%). Частота генотипов TT, CT и CC гена ITGB3 в обеих группах пациенток была практически одинаковой. При анализе аллельных вариантов изученных генов выявили следующее (табл. 3): у пациенток с артериальной гипертензией значительно реже выявляли аллельный вариант С гена ApoE (c.388 T>C). Частота встречаемости данного аллельного варианта в контрольной группе почти в 3 раза выше, чем в основной группе (14% против 5%). Аллельный вариант T гена ITGB3 1565 Т>C в основной группе выявляли несколько чаще, чем в контрольной (80 и 78% соответственно). Также у пациенток основной группы в гене ApoE (c.526 C>T) чаще обнаруживали аллельный вариант T (15% против 6% в контрольной группе). Нами выявлены достоверные различия (р = 0,001) между группами по гену ApoE (c.526 C>T). Данный результат позволяет предположить, что аллель T является аллелем риска в развитии артериальной гипертензии у пациенток, которым выполнена субтотальная гистерэктомия с удалением придатков. Отношение шансов OR (odds ratio) для аллеля T составило 15,8. Наше исследование позволяет выявить аллели риска развития артериальной гипертензии у изученной группы пациенток. Это аллельный вариант С гена ApoE (c.388 T>C) и аллельный вариант D гена ACE. Однако данное предположение требует дальнейших исследований на больших группах пациенток. Метаболический синдром При анализе генотипов пациенток из группы с метаболическим синдромом (n = 27) и контрольной группы (n = 11) (табл. 4) обнаружена бо́льшая частота выявления генотипа TC гена ApoE, полиморфизма c.388T>C (22,2% по сравнению с 9,1% в контрольной группе), бо́льшая частота выявления генотипа СС гена ApoE, полиморфизма c.526C>T (81,5% по сравнению с 72,7% в контрольной группе). Также в основной группе в полтора раза чаще обнаруживали генотип ID гена ACE, c.2306-109_2306-108ins288 (51,9% против 36,4% в группе контроля), а вариант DD - в 2,5 раза реже, чем в контрольной группе (14,8% против 36,4%). Генотип TT гена ITGB3 1565 Т>C в группе пациенток с метаболическим синдромом обнаруживали в 66,7% случаев, в контрольной группе данный вариант встречался у 54,5% обследованных. Гетерозиготу TC в основной группе выявляли в 29,6% случаев, а гомозиготный вариант CC - в 3,7%, в контрольной группе пациенток эти показатели составили 36,4 и 9,1% соответственно. При анализе аллельных вариантов изученных генов в обеих группах пациенток обнаружили следующее: в основной группе аллельный вариант С гена ApoE, c.388T>C встречался вдвое чаще, чем в контрольной группе (11,11 и 4,55% соответственно), аллельный вариант С гена ApoE c.526C>T также обнаруживали несколько чаще, чем в контрольной группе (91 и 86% соответственно), вариант I гена ACE выявляли в 59% в основной группе и только в 45% случаев в контрольной. Аллельный вариант T гена ITGB3 1565 Т>C в основной группе выявляли несколько чаще, чем в контрольной (81 и 73% соответственно) (табл. 5). Таким образом, полученные данные позволяют выделить кандидатные аллели риска развития МС у пациенток, которым выполнена субтотальная гистерэктомия с аднексэктомией. Это аллельный вариант С гена ApoE, c.388T>C, вариант С гена ApoE c.526C>T, вариант I гена ACE, вариант T гена ITGB3 1565 Т>C. Данное предположение требует дальнейших исследований на больших группах пациенток. Нарушения жирового обмена При анализе генотипов пациенток с нарушениями жирового обмена (n = 16) и пациенток контрольной группы (n = 22) обнаружена бо́льшая выявляемость генотипа TC гена ApoE, полиморфизма c.388T>C (25,0% по сравнению с 13,6% в контрольной группе), бо́льшая частота выявления генотипа СС гена ApoE, полиморфизма c.526C>T (81,3% по сравнению с 77,3% в контрольной группе). В основной группе несколько чаще обнаруживали генотип ID гена ACE, c.2306-109_2306-108ins288 (50,0% против 45,5% в группе контроля), а вариант DD - несколько реже, чем в контрольной группе (18,8% против 22,7%). Генотип TT гена ITGB3 1565 Т>C в группе пациенток с нарушениями жирового обмена обнаруживали в 68,8% случаев, в контрольной группе данный вариант встречался у 59,1% обследованных. Гетерозиготу TC в основной группе выявляли в 18,8% случаев, а гомозиготный вариант CC - в 12,5%, тогда как в контрольной группе пациенток гетерозиготу выявляли в 2 раза чаще (в 40,9% случаев), а гомозигота по варианту С вообще не встречалась. При анализе аллельных вариантов изученных генов обнаружили следующее: в основной группе аллельный вариант С гена ApoE, c.388T>C встречался вдвое чаще, чем в контрольной группе (13 и 7% соответственно), аллельный вариант С гена ApoE, c.526C>T также обнаруживали несколько чаще, чем в контрольной группе (91 и 89% соответственно), вариант I гена ACE выявляли в 56% в основной группе и в 55% случаев в контрольной (табл. 7). Аллельный вариант T гена ITGB3 1565 Т>C в основной группе выявляли несколько реже, чем в контрольной (78 и 80% соответственно). На основании полученных данных можно предположить, что аллель С гена ApoE c.388T>C может являться аллелем риска возникновения нарушений жирового обмена у пациенток, которым выполнена субтотальная гистероктомия с аднексэктомией. Это предположение требует дальнейших исследований на больших группах пациенток. Выводы В ходе исследования посредством анализа полиморфизма исследуемых генов были определены прогностические аллели риска развития АГ, нарушения жирового обмена и МС. Кандидатными аллелями риска развития МС у пациенток, которым выполнена субтотальная гистерэктомия с аднексэктомией, являются аллельный вариант С гена ApoE c.388T>C, вариант С гена ApoE c.526C>T, вариант I гена ACE, вариант T гена ITGB3 1565 Т>C. На основании полученных данных можно предположить, что аллель С гена ApoE c.388T>C может являться аллелем риска возникновения нарушений жирового обмена у пациенток, которым выполнено данное вмешательство. Наше исследование выявило также аллели риска развития АГ у изученной группы пациенток. Это аллельный вариант С гена ApoE (c.388 T>C) и аллельный вариант D гена ACE. Применение специфических генетических маркеров - аллелей риска позволяет прогнозировать вероятность развития АГ, нарушения жирового обмена, МС у пациенток после радикальных операций на матке и придатках. Данная методика позволяет персонифицировать подход к ранней диагностике вышеуказанных состояний.

About the authors

E. B Ginzburg

Kaluga Regional Clinical Hospital

Kaluga, 248007, Russian Federation

Elena A. Sosnova

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

Email: sosnova-elena@inbox.ru
MD, PhD, DSci., Professor of the Department of Obstetrics and Gynecology, Medical Faculty No 1 of the I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow, 119991, Russian Federation. Moscow, 119991, Russian Federation

L. V Tumbinskaya

Clinic of Innovative Technologies

Stavropol, 355042, Russian Federation

References

Supplementary files