Подход к получению циклических фоторасщепляемых РНК для фотоактивируемой системы CRISPR/Cas9

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Создание управляемых систем редактирования генома на основе технологии CRISPR/Cas – актуальная задача современной молекулярной биологии и генетической инженерии. Интересный вариант ее решения – модификация направляющих РНК путем введения фоточувствительных групп. Мы разработали подход к получению циклических фоторасщепляемых направляющих CRISPR РНК (crРНК) для системы CRISPR/Cas9, содержащих линкеры на основе 1-(2-нитрофенил)-1,2-этандиола (PL). В циклизованном состоянии такие направляющие РНК нефункциональны, а при облучении УФ-светом они линеаризуются, индуцируя активацию системы CRISPR/Cas9. Опробованы два химических подхода к образованию циклической РНК на основе реакции Михаэля (тиол-малеимидная конденсация) и медь-катализируемого азид-алкинового циклоприсоединения (реакция “клик”-химии). Для этого получены 5′,3′-модифицированные РНК, содержащие соответствующие реакционные группы. Продемонстрировано преимущество реакции азид-алкинового циклоприсоединения для получения циклических РНК. Эффективность образования циклических РНК зависит от их вторичной структуры и возможности сближения реакционных групп в пространстве. Получены серии фоторасщепляемых циклических crРНК и их контрольных нерасщепляемых аналогов. Показано, что циклические направляющие crРНК менее эффективно направляют нуклеазу Cas9 для расщепления плазмиды, при этом линеаризация фоторасщепляемых циклических crРНК значительно увеличивает эффективность расщепления плазмиды. Разработанный подход позволяет получать циклические фоторасщепляемые РНК, в том числе направляющие РНК для активации геномного редактирования CRISPR/Cas9 в заданный момент времени в определенном месте. Фоторегуляция геномного редактирования позволит снизить нежелательные нецелевые эффекты и проводить редактирование более прицельно.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Е. В. Иванская

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Новосибирский государственный университет

Email: danov@niboch.nsc.ru
Россия, 630090 Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8; 630090 Новосибирск, ул. Пирогова, 1

М. И. Мещанинова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: danov@niboch.nsc.ru
Россия, 630090 Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8;

М. А. Воробьева

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: danov@niboch.nsc.ru
Россия, 630090 Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8

Д. О. Жарков

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Новосибирский государственный университет

Email: danov@niboch.nsc.ru
Россия, 630090 Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8; 630090 Новосибирск, ул. Пирогова, 1

Д. С. Новопашина

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Новосибирский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: danov@niboch.nsc.ru
Россия, 630090 Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8; 630090 Новосибирск, ул. Пирогова, 1

Список литературы

  1. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. // Science. 2012. V. 337. P. 816–821. https://doi.org/10.1126/science.1225829
  2. Wang, J.Y., Pausch, P., Doudna, J.A. // Nat. Rev. Microbiol. 2022. V. 20. P. 641–656. https://doi.org/10.1038/s41579-022-00739-4
  3. Makarova K.S., Wolf Y.I., Iranzo J., Shmakov S.A., Alkhnbashi O.S., Brouns S.J.J., Charpentier E., Cheng D., Haft D.H., Horvath P., Moineau S., Mojica F.J.M., Scott D., Shah S.A., Siksnys V., Terns M.P., Venclovas Č., White M.F., Yakunin A.F., Yan W., Zhang F., Garrett R.A., Backofen R., van der Oost J., Barrangou R., Koonin E.V. // Nat. Rev. Microbiol. 2020. V. 18. P. 67–83. https://doi.org/10.1038/s41579-019-0299-x
  4. Brown W., Zhou W., Deiters A. // ChemBioChem. 2021. V. 22. P. 63–72. https://doi.org/10.1002/cbic.202000423
  5. Sun Y.-J., Chen W.-D., Liu J., Li J.-J., Zhang Y., Cai W.-Q., Liu L., Tang X.-J., Hou J., Wang M., Cheng L. // Angew. Chemie Int. Ed. 2023. V. 62. P. e202212413. https://doi.org/10.1002/anie.202212413
  6. Zhang Y., Ling X., Su X., Zhang S., Wang J., Zhang P., Feng W., Zhu Y.Y., Liu T., Tang X. // Angew. Chemie. 2020. V. 132. P. 21081–21085. https://doi.org/10.1002/anie.202009890
  7. Hartmann D., Booth M.J. // Commun. Chem. 2023. V. 6. P. 59. https://doi.org/10.1038/s42004-023-00860-2
  8. Darrah K.E., Deiters A. // Chem. Soc. Rev. 2021. V. 50. P. 13253-13267. https://doi.org/10.1039/d1cs00257k
  9. Wu Y., Yang Z., Lu Y. // Curr. Opin. Chem. Biol. 2020. V. 57. P. 95–104. https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2020.05.003
  10. Casey J.P., Blidner R.A., Monroe W.T. // Mol. Pharm. 2009. V. 6. P. 669–685. https://doi.org/10.1021/mp900082q
  11. Petkovic S., Müller S. // Nucl. Acids Res. 2015. V. 43. P. 2454–2465. https://doi.org/10.1093/nar/gkv045
  12. Obi P., Chen Y.G. // Methods. 2021. V. 196. P. 85–103. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2021.02.020
  13. Lietard J., Meyer A., Vasseur J.-J., Morvan F. // J. Org. Chem. 2008. V. 73. P. 191–200. https://doi.org/10.1021/jo702177c
  14. Wesselhoeft R.A., Kowalski P.S., Anderson D.G. // Nat. Commun. 2018. V. 9. P. 2629. https://doi.org/10.1038/s41467-018-05096-6
  15. Ji D., Lyu K., Zhao H., Kwok C.R. // Nucleic Acids Res. 2021. V. 49. P. 7280–7291. https://doi.org/10.1093/nar/gkab593
  16. Riccardi C., Meyer A., Vasseur J.-J., Krauss I.R., Paduano L., Morvan F., Montesarchio D. // Bioorg. Chem. 2020. V. 94. P. 103379. https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2019.103379
  17. Zhang X.-J., Zhao Z., Wang X., Su M.-H., Ai L., Li Y., Yuan Q., Wang X.-Q., Tan W. // Natl. Sci. Rev. 2022. V. 10. P. nwac107. https://doi.org/10.1093/nsr/nwac107
  18. Sánchez A., Pedroso E., Grandas A. // Chem. Commun. 2013. V. 49. P. 309–311. https://doi.org/10.1039/c2cc35357a
  19. Yamazoe S., Liu Q., McQuade L.E., Deiters A., Chen J.K. // Angew. Chem. Int. Ed. 2014. V. 53. P. 10114–10118. https://doi.org/10.1002/anie.201405355
  20. Brown W., Bardhan A., Darrah K., Tsang M., Deiters A. // J. Am. Chem. Soc. 2022. V. 144. P. 16819–16826. https://doi.org/10.1021/jacs.2c04479
  21. Klimek R., Wang M., McKenney V.R., Schuman E.M., Heckel A. // Chem. Commun. 2021. V. 57. P. 615– 618. https://doi.org/10.1039/d0cc06704k
  22. Yang L., Kim H.B., Sul J.-Y., Yeldell S.B., Eberwine J.H., Dmochowski I.J. // ChemBioChem. 2018. V. 19. P. 1250–1254. https://doi.org/10.1002/cbic.201800012
  23. Akhmetova E.A., Golyshev V.M., Vokhtantsev I.P., Meschaninova M.I., Venyaminova A.G., Novopashina D.S. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2021. V. 47. P. 496–504. https://doi.org/10.1134/S1068162021020023
  24. Semikolenova O., Sakovina L., Akhmetova E., Kim D., Vokhtantsev I., Golyshev V., Vorobyeva M., Novopashin S., Novopashina D. // Int. J. Mol. Sci. 2021. V. 22. P. 10919. https://doi.org/10.3390/ijms222010919
  25. Meschaninova M.I., Novopashina D.S., Semikolenova O.A., Silnikov V.N., Venyaminova A.G. // Molecules. 2019. V. 24. P. 4266. https://doi.org/10.3390/molecules24234266
  26. Novopashina D., Vorobyeva M., Nazarov A., Davydova A., Danilin N., Koroleva L., Matveev A., Bardasheva A., Tikunova N., Kupryushkin M., Pyshnyi D., Altman S., Venyaminova A. // Front. Pharmacol. 2019. V. 10. P. 813. https://doi.org/10.3389/fphar.2019.00813
  27. Danilin N.A., Koroleva L.S., Novopashina D.S., Venyaminova A.G. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2019. V. 45. P. 825–832. https://doi.org/10.1134/S106816201906013X
  28. Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E. // Nature. 2011. V. 471. P. 602–607. https://doi.org/10.1038/nature09886
  29. Sternberg S.H., Redding S., Jinek M., Greene E.C., Doudna J.A. // Nature. 2014. V. 507. P. 62–67. https://doi.org/10.1038/nature13011
  30. Shibata M., Nishimasu H., Kodera N., Hirano S., Ando T., Uchihashi T., Nureki O. // Nat. Commun. 2017. V. 8. Р. 1430. https://doi.org/10.1038/s41467-017-01466-8
  31. Kida S., Maeda M., Hojo K., Eto Y., Nakagawa S., Kawasaki K. // Chem. Pharm. Bull. 2007. V. 55. P. 685– 687. https://doi.org/10.1248/cpb.55.685
  32. Anders C., Jinek M. // Methods Enzymol. 2014. V. 546. P. 1–20. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-5
  33. Shubsda M.F., Goodisman J., Dabrowiak J.C. // J. Biochem. Biophys. Methods. 1997. V. 34. P. 73–79. https://doi.org/10.1016/S0165-022X(96)01204-3

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Предлагаемая в работе стратегия функционирования фоторегулируемой системы CRISPR/Cas9 с использованием циклических фотоблокированных crРНК. РАМ – мотив, прилегающий к протоспейсеру (protospacer adjacent motif).

Скачать (73KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Наиболее вероятные вторичные структуры циклических crРНК: C-42-P1, С-46-P1, С-46-P2, С-48-P1 и С-48-P2, полученные с помощью программы OligoAnalyzer (https://www.idtdna.com/calc/analyzer).

Скачать (116KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Профиль офВЭЖХ выделенных продуктов циклизации, соответствующих исходному линейному олигонуклеотиду (голубой) и циклической crРНК (серый). Хроматографию проводили в градиенте концентрации 0–50% CH3CN в 0.02 М триэтиламмонийацетате (pH 7.0). Время выхода пика циклического продукта С-46-Р1-cyc составило 571 с, исходного линейного 5′,3′-модифицированного олигорибонуклеотида C-46-P1 – 539 с.

Скачать (56KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Расщепление циклических РНК С-46-Р1 и С-46-Р2 под действием УФ-облучения. Электрофоретический анализ в 15%-ном денатурирующем ПААГ: 1 – циклический С-46-Р1, 2 – УФ-облученный циклический С-46-Р1, 3 – циклический С-46-Р2, 4 – УФ-облученный циклический С-46-Р2. Длина волны облучения – 365 нм, время облучения – 30 мин. Визуализацию РНК в геле проводили окрашиванием раствором красителя Stains-all. ВР – бромфеноловый синий.

Скачать (51KB)
Метаданные
6. Рис. 5. (а) – Схематическое изображение активного комплекса CRISPR/Cas9; (б) – электрофоретический анализ расщепления плазмидного субстрата. М – набор маркеров длины дцДНК, K– – контроль, содержащий плазмиду без фермента, К+ – плазмида после расщепления нуклеазой Cas9 с немодифицированной crРНК. УФ: знак “–” означает отсутствие облучения, знак “+” – облучение УФ-светом в течение 30 мин при 365 нм.

Скачать (148KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Эффективность расщепления ДНК плазмиды с использованием облученных и необлученных циклических фоторасщепляемых crРНК и их нерасщепляемых аналогов. К– – интактная плазмида; К+ – расщепление плазмиды нуклеазой Cas9 в присутствии пары немодифицированных направляющих РНК crРНК/tracrRNA; УФ: знак “–” означает отсутствие облучения, знак “+” – облучение УФ-светом в течение 30 мин при 365 нм.

Скачать (84KB)
Метаданные
8. Схема 1. Введение азидогруппы на 5'-конец 3'-алкинмодифицированного олигорибонуклеотида.

Скачать (69KB)
Метаданные
9. Схема 2. Получение олигорибонуклеотида, содержащего аминогруппу на 3'-конце и остаток цистамина на 5'-конце.

Скачать (105KB)
Метаданные
10. Схема 3. Получение олигорибонуклеотида, содержащего тиольную группу на 3'-конце и малеимидную группировку на 5'-конце.

Скачать (100KB)
Метаданные
11. Схема 4. Синтез циклического олигорибонуклеотида методом азид-алкинового циклоприсоединения.

Скачать (58KB)
Метаданные
12. Схема 5. Синтез циклического олигорибонуклеотида методом тиол-малеимидной конденсации.

Скачать (71KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024