Субстратное поведение разноименных CY5-дезоксипиримидиновых нуклеотидов в ПЦР с ДНК-матрицами различного GC-состава

Сравнили субстратные свойства шести пар флуоресцентно-меченных дезоксиуридин— и дезоксицитидинтрифосфатов (Cy5-dUTP и Cy5-dCTP) в ПЦР с Taq-полимеразой. В каждой паре модифицированные dU и dC содержали идентичные флуоресцентно-меченные заместители ряда Cy5; структуры заместителей в разных парах различались длиной линкера между азотистым основанием и флуорофором, длиной линкера между четвертичной аммониевой группой и вторым гетероциклом флуорофора, а также структурой самого флуорофора. В качестве матриц использовали фрагменты ДНК Staphylococcus aureus (АТ-богатая матрица) и Mycobacterium tuberculosis (GC-богатая матрица). Несколько большую эффективность амплификации (E) на обеих матрицах показали производные дезоксицитидина. Влияние структуры флуорофора и GC-состава матрицы на кинетику реакции было незначительным. При этом на АТ-богатой матрице наблюдали большую эффективность встраивания производных уридина; на GC-богатой матрице — производных цитидина, и в обоих случаях — заместителей с большей длиной линкеров. Тем не менее удельная плотность встраивания, которая учитывает количество одноименных нуклеотидов в цепи ДНК, во всех случаях была выше у производных dU. Обнаружено также, что в парах с аналогичными модификациями флуорофора производные уридина характеризуются большей плотностью встраивания, чем производные цитидина, вне зависимости от состава матрицы, но при этом имеют бóльший ингибирующий эффект. Полученные результаты позволят увеличить чувствительность флуоресцентного анализа с использованием иммобилизованной фазы (на биологических микрочипах).