Субстратное поведение разноименных CY5-дезоксипиримидиновых нуклеотидов в ПЦР с ДНК-матрицами различного GC-состава

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Сравнили субстратные свойства шести пар флуоресцентно-меченных дезоксиуридин— и дезоксицитидинтрифосфатов (Cy5-dUTP и Cy5-dCTP) в ПЦР с Taq-полимеразой. В каждой паре модифицированные dU и dC содержали идентичные флуоресцентно-меченные заместители ряда Cy5; структуры заместителей в разных парах различались длиной линкера между азотистым основанием и флуорофором, длиной линкера между четвертичной аммониевой группой и вторым гетероциклом флуорофора, а также структурой самого флуорофора. В качестве матриц использовали фрагменты ДНК Staphylococcus aureus (АТ-богатая матрица) и Mycobacterium tuberculosis (GC-богатая матрица). Несколько большую эффективность амплификации (E) на обеих матрицах показали производные дезоксицитидина. Влияние структуры флуорофора и GC-состава матрицы на кинетику реакции было незначительным. При этом на АТ-богатой матрице наблюдали большую эффективность встраивания производных уридина; на GC-богатой матрице — производных цитидина, и в обоих случаях — заместителей с большей длиной линкеров. Тем не менее удельная плотность встраивания, которая учитывает количество одноименных нуклеотидов в цепи ДНК, во всех случаях была выше у производных dU. Обнаружено также, что в парах с аналогичными модификациями флуорофора производные уридина характеризуются большей плотностью встраивания, чем производные цитидина, вне зависимости от состава матрицы, но при этом имеют бóльший ингибирующий эффект. Полученные результаты позволят увеличить чувствительность флуоресцентного анализа с использованием иммобилизованной фазы (на биологических микрочипах).

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

П. М. Монакова

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: polina.monakova02@gmail.com
Россия, Москва

В. Е. Шершов

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Email: polina.monakova02@gmail.com
Россия, Москва

В. Е. Кузнецова

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Email: polina.monakova02@gmail.com
Россия, Москва

А. В. Чудинов

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Email: polina.monakova02@gmail.com
Россия, Москва

С. А. Лапа

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Email: polina.monakova02@gmail.com
Россия, Москва

Список литературы

  1. Salic A., Mitchison T.J. (2008) A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 2415–2420.
  2. Smith C.I.E., Zain R. (2019) Therapeutic oligonucleotides: state of the art. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 59, 605–630.
  3. Yu H., Chao J., Patek D., Mujumdar R., Mujumdar S., Waggoner A.S. (1994) Cyanine dye dUTP analogs for enzymatic labeling of DNA probes. Nucl. Acids Res. 22, 3226–3232.
  4. Lapa S.A., Chudinov A.V., Timofeev E.N. (2016) The toolbox for modified aptamers. Mol. Biotechnol. 58, 79–92.
  5. Шершов В.Е., Кузнецова В.Е., Лысов Ю.П., Гусейнов Т.О., Барский В.Е., Спицын М.А., Заседателева О.А., Василисков В.А., Суржиков С.А., Заседателев А.С., Чудинов А.В. (2015) Влияние заряда хромофора на эффективность включения флуоресцентно-меченных нуклеотидов при матричном синтезе ДНК Taq-полимеразой. Биофизика. 60, 1216–1218.
  6. Лапа С.А., Гусейнов Т.О., Павлов А.С., Шершов В.Е., Кузнецова В.Е., Заседателев А.С., Чудинов А.В. (2020) Одновременное применение Cу5-модифицированных производных дезоксиуридина и дезоксицитидина в ПЦР. Биоорган. химия. 46, 418–424.
  7. Лисица Т.С., Шершов В.Е., Спицын М.А., Гусейнов Т.О., Иконникова А.Ю., Фесенко Д.О., Лапа С.А., Заседателев А.С., Чудинов А.В., Наседкина Т.В. (2017) Кинетика флуоресцентного маркирования ДНК с помощью полимеразной цепной реакции в зависимости от химического строения модифицированных нуклеотидов при использовании различных Taq-полимераз. Биофизика. 62, 49–56.
  8. Лапа С.А., Волкова О.С., Спицын М.А., Шершов В.Е., Кузнецова В.Е., Гусейнов Т.О., Заседателев А.С., Чудинов А.В. (2019) Эффективность амплификации и субстратные свойства флуоресцентно-меченных трифосфатов дезоксиуридина в ПЦР с ДНК-полимеразами, не обладающими 3ʹ-5ʹ-экзонуклеазной активностью. Биоорган. химия. 45, 392–402.
  9. Spitsyn M.A., Kuznetsova V.E., Shershov V.E., Emelyanova М.А., Guseinov T.O., Lapa S.A., Nasedkina T.V., Zasedatelev A.S., Chudinov A.V. (2017) Synthetic route to novel zwitterionic pentamethine indocyanine fluorophores with various substitutions. Dyes Pigments. 147, 199–210.
  10. Zasedateleva O.A., Vasiliskov V.A., Surzhikov S.A., Kuznetsova V.E., Shershov V.E., Guseinov T.O., Smirnov I.P., Yurasov R.A., Spitsyn M.A., Chudinov A.V. (2018) dUTPs conjugated with zwitterionic Cy3 or Cy5 fluorophore analogues are effective substrates for DNA amplification and labelling by Taq polymerase. Nucl. Acids Res. 46, e73.
  11. Шершов В.Е., Лапа С.А., Левашова А.И., Шишкин И.Ю., Штылев Г.Ф., Шекалова Е.Ю., Василисков В.А., Заседателев А.С., Кузнецова В.Е., Чудинов А.В. (2023) Синтез флуоресцентно-меченных нуклеотидов для маркирования продуктов изотермической амплификации. Биоорган. химия. 49, 649–656.
  12. Ramakers C., Ruijter J.M., Deprez R.H., Moorman A.F. (2003) Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neurosci. Lett. 339, 62–66.
  13. Peirson S.N., Butler J.N., Foster R.G. (2003) Experimental validation of novel and conventional approaches to quantitative real-time PCR data analysis. Nucl. Acids Res. 31, e73.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
2. Рис. 1. Структурные формулы флуоресцентных красителей Dye 1 (а), Dye 2 (б), Dye 3 (в), флуоресцентно-меченные 5-аллиламин-2ʹ-дезоксиуридин-5ʹ-трифосфат (AAdUTP) (г) и 5-аллиламин-2ʹ-дезоксицитидин-5ʹ-трифосфат (AAdCTP) (д).

Скачать (403KB)
3. Рис. 2. Скорость накопления продукта ПЦР на АТ-богатой матрице S. aureus (а) и GC-богатой матрице M. tuberculosis (б) на примере dUss и dCss. Контроль — образец без модифицированных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов.

Скачать (263KB)

© Российская академия наук, 2025